Распространенным признаком заболевания является наличие укороченных теломер. Теломеры — это структуры, которые защищают или «закрывают» концы хромосом, но они имеют тенденцию укорачиваться с делением клеток и возрастом и, таким образом, могут потерять свои защитные функции. Многие пациенты с ДК имеют мутацию в гене DKC1, который кодирует компонент фермента, называемого теломеразой, который помогает поддерживать длину теломер.
Поскольку теломераза наиболее важна в тканях, которые часто делятся, особенно в эпителиальных тканях, таких как кожа, кишечник и легкие, именно здесь у этих людей возникают дефекты.В новом исследовании, опубликованном в журнале Cell Stem Cell, исследователи из Пенсильванского университета под руководством Кристофера Дж. Ленгнера из Школы ветеринарной медицины и Брэда Джонсона из Медицинской школы Перельмана обнаружили связь между теломерами и молекулярным сигнальным каскадом, называемым Путь Wnt, который может указывать на вариант лечения пациентов с DC.
Первоначально связь была идентифицирована с использованием мышей в лаборатории Джонсона, и вместе группы Ленгнера и Джонсона распространили эти результаты на человеческие ткани в культуре, чтобы продемонстрировать, что стимуляция пути Wnt обращает признаки дисфункции, связанной с DC, в кишечнике.Их исследование подчеркивает наличие положительной обратной связи между передачей сигналов Wnt и функцией теломер, посредством чего стимуляция передачи сигналов Wnt активирует экспрессию белков, которые усиливают «шапку» на теломерах, приводя к более функциональным стволовым клеткам, что, в свою очередь, дополнительно стимулирует путь Wnt.Исследование также дает представление о стратегиях борьбы с дисфункцией теломер, процессом, который также был связан с некоторыми видами рака и естественным старением.
«То, что вы видите у мутантных мышей и пациентов с врожденным дискератозом, является следствием меньшей активности теломеразы в быстро делящихся тканях», — сказал Джонсон, соавтор исследования и доцент кафедры патологии и лабораторной медицины Penn Medicine. «Это не то же самое, что естественное старение, когда у вас могут быть теломерные дефекты в клетках, которые изначально не имеют большой активности теломеразы. Но я думаю, что справедливо сказать, что наши результаты дают понимание того, что может происходить поскольку теломеры укорачиваются с возрастом ".Ленгнер, доцент кафедры биомедицинских наук Пенсильванского университета, был соавтором исследования.«Сейчас основной терапией для этих пациентов является пересадка костного мозга», — сказал Ленгнер. «Это может решить проблему недостаточности костного мозга, но не решает других проблем, связанных с заболеванием, и особенно риска рака.
Эта работа предлагает способ устранения основной причины заболевания».Более ранние исследования с мышиными моделями DC показали, что может существовать связь между путем Wnt и теломеразой.
А недавнее исследование клеток пациентов с DC обнаружило снижение активности пути Wnt. Поэтому исследователи из Пенсильвании хотели выяснить, может ли активация Wnt обратить вспять последствия болезни.Для этого команда использовала три зарождающихся метода. Во-первых, они использовали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК, которые представляют собой взрослые клетки, которые «перепрограммированы», чтобы они очень напоминали эмбриональные стволовые клетки.
Это позволило исследователям взять клетки у пациентов с DC, а также у здоровых людей, и преобразовать их так, чтобы клетки, такие как стволовые, могли давать начало множеству различных типов клеток.Во-вторых, они использовали систему CRISPR / Cas9, простой метод с драматическими эффектами. Подобно вырезанию и вставке для генома, он создает двухцепочечные разрывы в определенном участке ДНК, а затем восстанавливает его, включая новую желаемую последовательность, используя гомологичную рекомбинацию.
Исследователи использовали эту систему редактирования генов, чтобы ввести мутацию DKC1 в ИПСК здорового человека, а также исправить вызывающую заболевание мутацию в ИПСК из образцов пациентов с ДК. Таким образом, они сопоставили наборы клеточных линий для тестирования, что могло исключить влияние любых фоновых генетических вариаций.Наконец, исследователи вырастили так называемые «органоиды», рост in vitro, напоминающий орган, посредством процесса, называемого направленной дифференцировкой, при котором ИПСК получали определенные молекулы, имитирующие сигналы, которые стволовые клетки получают при нормальном развитии. В этом случае клетки уговорили сформировать органоид кишечника человека, который естественным образом образует трубчатую структуру, повторяя трубки желудочно-кишечной системы человека.
Когда команда Пенна наблюдала за развитием органоида кишечника, они обнаружили, что первоначально клетки пациентов с DC, казалось, формировались нормально.«Но в тот момент, когда они должны были сделать кишечник и сформировать кишечную трубку, все развалилось», — сказал Ленгнер.
В то время как образцы здоровых пациентов и образцы от пациентов DC, которые были скорректированы с помощью CRISPR, образовали пробирку, исходные клетки пациентов и клетки, в которых была введена болезненная мутация, введенная CRISPR, по-видимому, следовали нормальному курсу развития в течение нескольких дней. , но к двум неделям исчезла трубчатая структура, наблюдаемая в здоровых образцах и образцах с исправленным заболеванием. Эти клетки также имели более короткие теломеры, при этом кишечные органоиды пациентов с ДК имели самые короткие из всех типов клеток.«Мы могли видеть на молекулярном уровне, что это сопровождается неспособностью активировать определенные программы генов стволовых клеток кишечника, — сказал Ленгнер, — особенно гены пути Wnt».
Следующим логическим шагом для исследователей была активация Wnt, чтобы посмотреть, можно ли исправить эти дефекты. Они обработали органоиды, полученные из ИПСК пациентов с ДК, соединением под названием CHIR, которое стимулирует путь Wnt, и обнаружили, что оно восстанавливает образование трубчатой ??структуры, а также экспрессию генов стволовых клеток кишечника.
Обработка также увеличивала активность теломеразы и длину теломер в клетках с мутантным DKC1.Чтобы оценить этот подход к лечению на более клинически релевантной модели, они трансплантировали органоиды кишечника человека мышам.
Мыши, которые получили трансплантат, содержащий мутацию DKC1, а также лечили одобренным FDA стимулятором пути Wnt, литием, сохранили структуру своей ткани кишечника и имели высокую экспрессию генов-мишеней Wnt. По сути, они напоминали мышей, которым трансплантировали органоид, полученный от здорового пациента.
По словам исследователей, исследование предлагает доказательство принципа того, что активация пути Wnt может обратить вспять, по крайней мере, желудочно-кишечные фенотипы, связанные с врожденным дискератозом. Забегая вперед, они хотели бы попытаться проделать то же самое с другими типами тканей, пораженных болезнью, таких как легкие и даже кровь.
И хотя литий является одобренным лекарством, он не селективен в отношении пути Wnt и имеет побочные эффекты, и, таким образом, «скрининг дополнительных терапевтических агентов может быть полезным», — сказал Джонсон.