МДД — это тяжелое мышечное дегенеративное заболевание, вызванное мутацией потери функции в гене дистрофина. От него страдает 1 из 3500 мальчиков и обычно приводит к смерти в раннем взрослом возрасте.
В настоящее время очень мало доступно для лечения пациентов вне паллиативной помощи. Один из вариантов, вызывающих интерес, — это редактирование генома с помощью TALEN и CRISPR, которые быстро стали бесценными инструментами в молекулярной биологии. Эти ферменты позволяют ученым расщеплять гены в определенных местах, а затем изменять остатки для создания геномной последовательности по своему вкусу.
Однако программируемые нуклеазы не являются чистыми и часто ошибочно редактируют аналогичные последовательности, которые отличаются на несколько пар оснований от целевой последовательности, что делает их ненадежными для клинического использования из-за возможности возникновения нежелательных мутаций.По этой причине индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) являются идеальными моделями, поскольку они предоставляют исследователям множество клеток пациента, на которых можно протестировать программируемые нуклеазы и найти оптимальные условия, которые минимизируют модификации, не соответствующие цели. Ученые CiRA воспользовались этой функцией, сгенерировав iPS-клетки у пациента с МДД. Они использовали несколько различных TALEN и CRISPR для модификации генома iPS-клеток, которые затем были дифференцированы в клетки скелетных мышц.
Во всех случаях экспрессия белка дистрофина выздоровела, а в некоторых случаях полностью скорректирован ген дистрофина.Одним из ключей к успеху была разработка вычислительного протокола, который сводил к минимуму риск нецелевого редактирования. Команда создала базу данных, содержащую все возможные перестановки последовательностей длиной до 16 пар оснований.
Среди них они извлекли те, которые появляются в геноме человека только один раз, то есть уникальные последовательности. МДД может быть вызван несколькими различными мутациями; В случае пациента, использованного в этом исследовании, это было результатом делеции экзона 44.
Поэтому исследователи построили гистограмму уникальных последовательностей, которые появились в области генома, содержащей этот экзон. Они обнаружили стопку уникальных последовательностей в экзоне 45. По словам Акицу Хотта, возглавлявшего проект и занимающего совместные должности в CiRA и Институте комплексных исследований клеточных материалов при Киотском университете, «почти половина генома человека состоит из повторяющихся последовательностей. Таким образом, даже если мы нашли одну уникальную последовательность, изменение одной или двух пар оснований может привести к этим другим повторяющимся последовательностям, что может привести к тому, что TALEN или CRISPR отредактируют неправильную область. гистограмма ".
С этой целью команда рассмотрела три стратегии для модификации мутации со сдвигом рамки считывания гена дистрофина: пропуск экзона путем соединения экзонов 43 и 46 для восстановления рамки считывания, сдвиг рамки за счет включения инсерционных или делеционных (инделирующих) мутаций и нокаут экзона. -in путем вставки экзона 44 перед экзоном 45. Все три стратегии эффективно увеличивали синтез дистрофина в дифференцированных скелетных клетках, но только подход с ударением экзона восстановил ген до его естественного состояния. Важно отметить, что редактирование показало очень высокую специфичность, предполагая, что их вычислительный подход может быть использован для минимизации нецелевого редактирования программными нуклеазами.Кроме того, в документе приводится доказательство принципа использования технологии iPS-клеток для лечения МДД в ??сочетании с TALEN или CRISPR.
В настоящее время группа стремится распространить этот протокол на другие заболевания. Первый автор Лиза Ли объясняет: «Мы показываем, что TALEN и CRISPR могут использоваться для исправления мутации гена DMD.
Я хочу применить нуклеазы для исправления мутаций при других генетических заболеваниях, таких как точечные мутации».