Подробный рассказ:Генетическая информация ДНК транскрибируется в информационную РНК в процессе, известном как транскрипция.
После транскрипции мРНК переносит генетическую информацию из ядра клетки в цитоплазму. Там он служит руководством для производства белков. Белки, в свою очередь, являются рабочими лошадками в клетке и выполняют все клеточные задачи.Как и двухцепочечная ДНК, одноцепочечная РНК состоит из цепочки так называемых нуклеотидов.
Однако в РНК эти нуклеотиды претерпевают множество химических изменений, известных как модификации РНК. Эти модификации происходят после того, как генетическая информация была прочитана. При этом к нуклеотидам присоединяются простые атомные структуры — метильные группы. «Одной из модификаций, которая в настоящее время горячо обсуждается, является N6-метиладенозин, сокращенно известный как m6A», — говорит Андреа Рентмейстер.
Есть особая причина, по которой эта модификация очень интересна, и это потому, что она, по-видимому, отвечает за ряд биологических процессов, например, за циркадные часы. Также кажется, что он играет роль в патологических процессах, например, при некоторых формах рака или вирусных инфекциях.
Биохимики назвали модификации РНК химио-ферментативными методами.Чтобы лучше понять m6A, исследователи хотят найти ответ на вопрос: где именно в мРНК находится модификация?
Чтобы узнать это, они должны пометить это. Для этого биологи часто используют антитела, которые прикрепляются к исследуемой молекуле. Этот метод имеет свои ограничения, однако антитела могут связываться не только с модификациями мРНК, но и с соседними нуклеотидами.
Это затрудняет точное определение местонахождения модификаций. «Теперь мы хотели проводить маркировку с использованием химического подхода», — объясняет Андреа Рентмайстер. Итак, впервые она и ее команда использовали пропаргильные группы, немного более длинный углеводородный остаток.Исследователи соединили пропаргильные группы с косубстратом фермента и объединили все три компонента с молекулами мРНК в пробирке. По своей химической структуре пропаргил похож на природную молекулу, связанную метилтрансферазой.
В свою очередь, метилтрансферазы являются ферментами, отвечающими за модификацию мРНК. Таким образом, метилтрансферазы смогли перенести пропаргильную группу на РНК. Используя так называемую клик-химию, ученые смогли выделить и очистить РНК с помощью пропаргильных групп.
Молекулярные биологи обнаружили модификации РНК с помощью секвенирования нового поколенияЧтобы обнаружить специально помеченные модификации, исследователи использовали специальный фермент для транскрипции мРНК обратно в ДНК.
Полученная цепь ДНК является копией предыдущей РНК и может быть исследована с помощью молекулярно-биологических методов. Группа молекулярных биологов из Кластера передового опыта «Клетки в движении» и Института молекулярной биомедицины Макса Планка в Мюнстере во главе с Себастьяном Лейделем секвенировала эту недавно синтезированную цепь ДНК, другими словами, они считали последовательности нуклеотидов. При этом исследователи использовали метод, известный как секвенирование следующего поколения, который позволил им чрезвычайно эффективно определять последовательности нуклеотидов. «Этот метод позволяет нам анализировать тысячи последовательностей параллельно», — объясняет Себастьян Лейдель.Поскольку исследователи обозначили модификации пропаргильными группами, ферменты, необходимые для перезаписи РНК, были арестованы.
В результате им не удалось транскрибировать РНК обратно в ДНК. «Ферменты прекратили любую активность на помеченных участках и создали своего рода стоп-сигнал», — говорит Катя Хартсток, химик и ведущий автор статьи. Исследователи смогли определить эти стоп-сигналы во время секвенирования, что означало, что они могли обнаружить сайты, в которых произошла модификация мРНК.После первоначальных экспериментов в пробирке исследователи применили свой новый метод в культуре эпителиальных клеток человека — клеток HeLa.
Исследователи скармливали клеткам так называемый предшественник аминокислот, меченный пропаргилом, который клетки «съели», а затем начали мечение. Как уже было установлено в пробирке, пропаргильные группы прикреплялись к РНК с помощью метилтрансфераз и позволяли обнаруживать сайты модификации мРНК с помощью секвенирования следующего поколения.
Следующим шагом, который хотят предпринять исследователи, является применение их метода к живым организмам, чтобы изучить значение модификации в их развитии. Рыбки данио хорошо подходят для этой цели, поскольку они развиваются очень быстро, и поэтому модификации быстрее записываются, а также быстрее удаляются.