Первоначально обнаруженный как часть иммунной системы бактерий Streptococcus pyogenes, CRISPR-ассоциированный белок 9 (CAS9) в своем нативном состоянии распознает чужеродные последовательности ДНК и отключает их.В бактериях система используется для нацеливания на чужеродную вирусную ДНК из бактериофагов — ДНК, которую он уже признал врагом в своей эволюционной истории и включил запись об этом в свою собственную ДНК.CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами, произносится как «четче») представляют собой сегменты ДНК, которые содержат короткие повторы базовых последовательностей, за которыми следуют короткие сегменты «спейсерной ДНК», полученные в результате предыдущих воздействий чужеродной ДНК.
Комплекс состоит из белков, которые распутывают ДНК, других белков, которые разрезают двойную спираль в определенном месте, и направляющей РНК, которая может распознавать вражескую ДНК в клетке.Исследователи, изучающие эту древнюю иммунную систему, поняли, что, изменив последовательность управляющей РНК для соответствия заданной цели, ее можно использовать для разрезания не только вирусной ДНК, но и любой последовательности ДНК в точно выбранном месте. Более того, новые участки ДНК могут быть введены для присоединения к недавно вырезанным участкам.
Метод был впервые задуман и разработан Дженнифер Доудна (Калифорнийский университет, Беркли) и Эммануэль Шарпантье (Университет Умео) и использовался в культивируемых клетках, включая STEM-клетки, и в оплодотворенных яйцах для создания трансгенных животных с целевыми мутациями, которые помочь изучить генетические функции. CRISPR / Cas9 может воздействовать на многие гены одновременно, что позволяет лечить заболевания, связанные с взаимодействием многих генов.Этот метод быстро совершенствуется и, как ожидается, однажды найдет применение в фундаментальных исследованиях, разработке лекарств, сельском хозяйстве и лечении людей с генетическими заболеваниями.Однако создание целевых мутаций CRISPR / Cas9 в настоящее время является дорогостоящим и требует много времени, особенно для крупномасштабных исследований.
Этот процесс также подвержен ошибкам, что ограничивает его широкое распространение. Эти проблемы частично связаны с отсутствием полного понимания того, как CRISPR / Cas9 работает на молекулярном уровне.В ноябре группа исследователей из Университета Северного Техаса (UNT) во главе с Цзинь Лю использовала суперкомпьютер Maverick в Техасском центре передовых вычислений (TACC) для проведения первого полностью атомного молекулярно-динамического моделирования расщепления ДНК, катализируемого Cas9, в действии. .Моделирование, опубликованное в Nature Scientific Reports, пролило свет на процесс редактирования генома Cas9. Они также помогли разрешить разногласия по поводу конкретных аспектов разрезания: например, где именно происходят изменения и генерирует ли Cas9 тупые или ступенчатые разрывы с выступами в ДНК.
«В настоящее время существует довольно много проблем с тем, как мы используем это в терапевтических целях. Специфичность и эффективность фермента невысоки», — сказал Лю. «Также сложно доставить фермент на место редактирования гена. Чтобы решить эти проблемы, во-первых, нам нужно знать, как работает этот фермент. Наши исследования обеспечивают основу для понимания механизма Cas9».
Ученые ранее определили структуру Cas9 в его неактивном состоянии с помощью рентгеновской кристаллографии, но процесс редактирования гена происходит так быстро, что никакая экспериментальная техника не может зафиксировать изменения его состояния и точно определить, как он работает.Используя моделирование молекулярной динамики — метод изучения динамики молекул путем моделирования взаимодействий большого числа атомов в течение фиксированного времени — Лю и соавтор Чжиченг Цзо, также в UNT, смогли наблюдать изменения в Фермент Cas9 с фемтосекундным разрешением и фиксирует переход системы в активное состояние.Моделирование включало ионы Mg2 +, которые, как полагают, вызывают изменения конформации в Cas9, чтобы он мог функционировать. Исследователи предположили, что ионы Mg2 + вызывают конформационные изменения в активное состояние, облегчая близость активных центров Cas9 и ДНК.
Моделирование, проведенное Лю и Цзо на Maverick, охватывало 280 000 взаимодействующих атомов. Самым сложным, по словам Лю, была эффективная выборка пространств конформации для определения активного состояния.«Мы изо всех сил старались повысить надежность наших результатов моделирования», — сказал Лю. «Мы сделали несколько длинных 200 и 300 наносекундных траекторий, а также несколько коротких траекторий продолжительностью 60 наносекунд, чтобы обеспечить согласованные результаты.
Для каждой конфигурации мы выполнили не менее шести параллельных симуляций».Помимо изучения того, как комплекс CRISPR / Cas9 переходит в активное состояние, моделирование пролило свет на то, где он отрезал ДНК.
«Обычно люди считают, что его сокращают на одной позиции, но нет четких доказательств этого», — сказал Лю, доцент кафедры фармацевтических наук в UNT. «Используя наши вычислительные методы, мы определили, что разрезание происходит в другом месте, что может означать, что этот фермент может разрезать ДНК более контролируемым способом. Таким образом, выполняя эту работу, мы открываем дверь для разработки более эффективного фермента, который мог бы разрезать ДНК. ДНК более конкретным образом ".
Их заключительный вклад дал ответ на вопрос, приводит ли редактирование генома к тупым или смещенным концам — нерешенный вопрос с практическими последствиями.CRISPR / Cas9 разрезает обе половины двухцепочечной ДНК. Если резать в одном и том же месте на обеих прядях, концы будут тупыми; если он будет разрезать немного в другом месте, это приведет к смещению концов. Их моделирование показало, что CRISPR / CAS9 создает ступенчатые концы.
«Это будет очень важно для редактирования генов, потому что ДНК с шахматным концом более управляема, чем ДНК с тупым концом», — сказала она.Иок-Хоу Панг, заведующий кафедрой фармацевтических наук в UNT, использует CRISPR / Cas9 для проведения экспериментальных исследований глаз в своей лаборатории.
Как для своих текущих, так и для будущих исследований он видит ценность более четкого понимания поведения фермента.«Моя лаборатория использовала систему редактирования генов CRISPR / Cas9 для подавления нового белка в культивируемых астроглиальных клетках зрительного нерва мыши», — сказал Панг. «Работа доктора Лю поможет нам понять молекулярное взаимодействие между ферментной системой и ее субстратом и в конечном итоге поможет повысить ее эффективность, что чрезвычайно полезно для этого замечательного молекулярного метода».В 2015 году под эгидой Национальной академии наук глобальные ученые объявили мораторий на использование CRISPR / Cas9 для редактирования генома человека способами, которые могут быть унаследованы (хотя есть признаки того, что исследователи уже нарушили этот запрет). По их словам, слишком мало известно о процессе и долгосрочных последствиях этого.
Но исследования, подобные исследованиям Лю, могут однажды сыграть роль в доводке этих инструментов и сделать их доступными для использования людьми.«Мы пытаемся понять механизм фермента редактирования генома, который может иметь большой потенциал для будущих фармацевтических и терапевтических применений, и который может приблизить нас к позиции, где эта технология может быть использована при заболеваниях человека», — сказал Лю, «Без TACC. ресурсов, это исследование было бы невозможно выполнить ».