CRISPR-Gold исправляет мутацию мышечной дистрофии Дюшенна у мышей

С 2012 года, когда соавтор исследования Дженнифер Дудна, профессор молекулярной и клеточной биологии и химии в Калифорнийском университете в Беркли, и коллега Эммануэль Шарпантье из Института биологии инфекций Макса Планка перепрофилировали белок Cas9, чтобы создать дешевый, точный и Простого в использовании редактора генов исследователи надеялись, что методы лечения, основанные на CRISPR-Cas9, однажды произведут революцию в лечении генетических заболеваний. Тем не менее, разработка методов лечения генетических заболеваний остается большой проблемой в медицине.

Это связано с тем, что большинство генетических заболеваний можно вылечить только в том случае, если мутацию вызывающего заболевание гена исправить до нормальной последовательности, а это невозможно сделать с помощью обычных терапевтических средств.CRISPR / Cas9, однако, может исправлять генные мутации, разрезая мутировавшую ДНК и запуская гомологически направленную репарацию ДНК. Однако стратегии для безопасной доставки необходимых компонентов (Cas9, направляющая РНК, которая направляет Cas9 к конкретному гену и донорская ДНК) в клетки должны быть разработаны до того, как можно будет реализовать потенциал терапевтических средств на основе CRISPR-Cas9.

Обычный метод доставки CRISPR-Cas9 в клетки использует вирусы, но этот метод имеет ряд осложнений. CRISPR-Gold не требует вирусов.

В новом исследовании, проведенном лабораториями профессоров биоинженерии Беркли Нирена Мурти и Ирины Конбой, было продемонстрировано, что их новый подход, названный CRISPR-Gold, поскольку наночастицы золота являются ключевым компонентом, может доставлять Cas9 — белок, который связывает и разрезает ДНК — — вместе с РНК и донорской ДНК направлять в клетки живого организма для фиксации генной мутации.«CRISPR-Gold — это первый пример средства доставки, которое может доставлять все компоненты CRISPR, необходимые для исправления генных мутаций, без использования вирусов», — сказал Мурти.Исследование было опубликовано 2 октября в журнале Nature Biomedical Engineering.CRISPR-Gold восстанавливает мутации ДНК с помощью процесса, называемого гомологически направленной репарацией.

Ученые изо всех сил пытались разработать терапевтические средства, основанные на гомологически направленной репарации, потому что они требуют активности в том же месте и в то же время, что и белок Cas9, РНК-гид, который распознает мутацию и донорскую ДНК для исправления мутации.Чтобы преодолеть эти проблемы, ученые из Беркли изобрели сосуд для доставки, который связывает все эти компоненты вместе, а затем высвобождает их, когда сосуд находится внутри самых разных типов клеток, запуская гомологически направленную репарацию.

Золотые наночастицы CRISPR-Gold покрывают донорскую ДНК, а также связывают Cas9. При введении мышам их клетки распознают маркер в CRISPR-Gold и затем импортируют сосуд для доставки. Затем посредством ряда клеточных механизмов CRISPR-Gold попадает в цитоплазму клеток и распадается на части, быстро высвобождая Cas9 и донорскую ДНК.Одна инъекция CRISPR-Gold в мышечную ткань мышей, моделирующих мышечную дистрофию Дюшенна, восстановила 5,4 процента гена дистрофина, вызывающего заболевание, до последовательности дикого типа или нормальной последовательности.

Этот коэффициент коррекции был примерно в 18 раз выше, чем у мышей, получавших Cas9 и донорскую ДНК отдельно, у которых коэффициент коррекции составлял всего 0,3 процента.Важно отметить, что, как отмечают авторы исследования, CRISPR-Gold точно восстановил нормальную последовательность дистрофина, что является значительным улучшением по сравнению с ранее опубликованными подходами, которые удаляли только дефектную часть гена, делая его короче и превращая одно заболевание в другое, более легкое заболевание.CRISPR-Gold также смог уменьшить фиброз тканей — отличительный признак заболеваний, при которых мышцы не функционируют должным образом — и повысил силу и ловкость у мышей с мышечной дистрофией Дюшенна. Мыши, обработанные CRISPR-Gold, показали двукратное увеличение времени зависания в общем тесте на силу и ловкость мышей по сравнению с мышами, которым вводили контрольную инъекцию.

«Эти эксперименты предполагают, что можно будет разработать невирусные терапевтические средства CRISPR, которые могут безопасно исправлять генные мутации посредством процесса гомологически направленной репарации, просто разрабатывая наночастицы, которые могут одновременно инкапсулировать все компоненты CRISPR», — сказал Мурти.Исследование показало, что подход CRISPR-Gold к доставке белка Cas9 более безопасен, чем вирусная доставка CRISPR, который, помимо токсичности, усиливает побочные эффекты Cas9 за счет непрерывной экспрессии этого фермента, расщепляющего ДНК. Когда исследовательская группа проверила способность CRISPR-Gold к редактированию генов на мышах, они обнаружили, что CRISPR-Gold эффективно исправляет мутацию ДНК, вызывающую мышечную дистрофию Дюшенна, с минимальным повреждением коллатеральной ДНК.

Исследователи количественно оценили повреждение ДНК CRISPR-Gold вне мишени и обнаружили уровни повреждений, аналогичные типичной ошибке секвенирования ДНК в типичной клетке, которая не подвергалась воздействию CRISPR (0,005–0,2 процента). Для проверки возможной иммуногенности профили цитокинов кровотока мышей анализировали через 24 часа и две недели после инъекции CRISPR-Gold.

CRISPR-Gold не вызывал резкой активации воспалительных цитокинов в плазме после нескольких инъекций или потери веса, что позволяет предположить, что CRISPR-Gold можно безопасно использовать несколько раз и что он имеет высокое терапевтическое окно для редактирования генов в мышцах. ткань.«CRISPR-Gold и, в более широком смысле, CRISPR-наночастицы открывают новый путь для более безопасной и точно контролируемой доставки инструментов для редактирования генов», — сказал Конбой. «В конечном счете, эти методы могут стать новым лекарством от мышечной дистрофии Дюшенна и ряда других генетических заболеваний».

Потребуется клиническое испытание, чтобы определить, является ли CRISPR-Gold эффективным средством лечения генетических заболеваний у людей. Соавторы исследования Куну Ли и Хё Мин Пак создали стартап GenEdit (Мурти владеет долей участия в GenEdit), которая сосредоточена на внедрении технологии CRISPR-Gold на человека. Лаборатории Мерти и Конбоя также работают над следующим поколением частиц, которые могут доставлять CRISPR в ткани из кровотока и предпочтительно нацелены на взрослые стволовые клетки, которые считаются лучшими мишенями для генной коррекции, поскольку стволовые клетки и клетки-предшественники способны к редактирование генов, самообновление и дифференциация.

«Генетические заболевания вызывают ужасающие уровни смертности и заболеваемости, и крайне необходимы новые стратегии их лечения», — сказал Мурти. «CRISPR-Gold смог исправить вызывающие заболевание генные мутации in vivo за счет невирусной доставки белка Cas9, направляющей РНК и донорской ДНК, и, следовательно, может стать терапевтическим средством для лечения генетических заболеваний».

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *