Новые ферменты CRISPR представляют собой варианты белка CRISPR, Cas13a, который, как сообщили исследователи Калифорнийского университета в Беркли в сентябре прошлого года в журнале Nature, можно использовать для обнаружения определенных последовательностей РНК, например, из вируса. Они показали, что как только CRISPR-Cas13a связывается со своей РНК-мишенью, он начинает без разбора разрезать всю РНК, легко разрезая РНК, связанную с репортерной молекулой, заставляя ее флуоресцировать, что позволяет обнаруживать сигнал.Две группы исследователей из Института Броуда впоследствии соединили CRISPR-Cas13a с амплификацией РНК и показали, что система, которую они назвали SHERLOCK, может обнаруживать вирусную РНК в чрезвычайно низких концентрациях, обнаруживая, например, присутствие РНК вирусов денге и вируса Зика.
Такую систему можно использовать для обнаружения любого типа РНК, включая РНК, характерную для раковых клеток.В то время как оригинальный фермент Cas13a, используемый командами Калифорнийского университета в Беркли и Броуд, разрезает РНК по одной конкретной нуклеиновой кислоте, урацилу, три новых варианта Cas13a разрезают РНК по аденину. Это различие позволяет одновременно обнаруживать две разные молекулы РНК, например, от двух разных вирусов.«Мы сделали шаг вперед в наших фундаментальных исследованиях в поиске других гомологов семейства Cas13a, которые имеют разные нуклеотидные предпочтения, что позволяет одновременно обнаруживать разные репортеры, скажем, с красным и зеленым флуоресцентным сигналом, что позволяет использовать мультиплексную систему ферментативного обнаружения», сказала первый автор Александра Ист-Селецки, аспирантка Калифорнийского университета в Беркли в лаборатории Дженнифер Дудна, одного из изобретателей инструмента редактирования генов CRISPR-Cas9.
Восточно-Селецкий также был соавтором сентябрьской газеты Nature.Ист-Селецкий, Дудна и их коллеги из Калифорнийского университета в Беркли сообщат о своих открытиях 4 мая в журнале Molecular Cell.Серия убийств РНК
Семейство CRISPR-Cas13a, ранее называвшееся CRISPR-C2c2, связано с CRISPR-Cas9, который уже произвел революцию в биомедицинских исследованиях и лечении благодаря простоте нацеливания на уникальные последовательности ДНК для вырезания или редактирования. В то время как белок Cas9 разрезает двухцепочечную ДНК по определенным последовательностям, белок Cas13a — фермент, расщепляющий нуклеиновые кислоты, называемый нуклеазой, — фиксируется на определенных последовательностях РНК и не только разрезает эту конкретную РНК, но и выходит из себя, чтобы разрезать и уничтожить всю присутствующую РНК.«Думайте о связывании между Cas13a и его РНК-мишенью как о переключателе — связывание с мишенью включает фермент, который превращается в Pac-Man в клетке, пережевывая всю РНК поблизости», — сказал Ист-Селецкий.
Эта серия убийств РНК может убить клетку.В своей сентябрьской статье Nature исследователи из Калифорнийского университета в Беркли утверждали, что активность CRISPR-Cas13a в Pac-Man является его основной ролью в бактериях, направленной на уничтожение инфекционных вирусов или фагов.
Являясь частью иммунной системы некоторых бактерий, он позволяет инфицированным клеткам совершать самоубийство, чтобы спасти своих сестринских микробов от инфекции. Подобные системы самоубийств, не относящиеся к CRISPR, существуют и у других бактерий.Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли впоследствии провели поиск в базах данных бактериальных геномов и нашли 10 других Cas13a-подобных белков, которые они синтезировали и изучили, чтобы оценить их способность находить и разрезать РНК. Из них семь напоминали оригинальный Cas13a, а три различались по месту разрезания РНК.
РНК, которая выполняет множество функций внутри клетки, в том числе как информационная РНК — рабочие копии ДНК — состоит из четырех различных нуклеотидов: аденина, цитозина, гуанина и урацила.«Основываясь на нашей первоначальной работе, мы теперь показываем, что можно мультиплексировать эти ферменты вместе, расширяя возможности технологии», — сказал Ист-Селецкий. «В семействе CRISPR-Cas13a так много разнообразия, что его можно использовать для многих приложений, включая обнаружение РНК».
Дудна, профессор молекулярной биологии и химии и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза, отметил, что обнаружение инфекционной РНК может потребовать, а может и не потребовать амплификации, что является сложным этапом.«Наше намерение состоит в том, чтобы разработать семейство ферментов Cas13a для диагностики на месте, которые будут надежными и простыми в использовании», — сказал Дудна.