Какие вирусы заражают слона? Какой тип бактерий вызывает тяжелое заболевание легких у бурого зайца? Молекулярно-биологические анализы образцов тканей всегда ставят ученых перед одной и той же проблемой: как извлечь геном конкретного патогена из смеси ДНК пациента и его микробных сожителей? «Очень легко», — говорит Алекс Гринвуд из Немецкого института зоопарков и диких животных имени Лейбница. «Короткая одноцепочечная последовательность оснований предлагается приготовленному супу из ДНК в качестве приманки.
Теперь, когда это происходит, не только комплементарная целевая последовательность попадает на приманку, но постепенно и многие другие соседние сегменты делают то же самое». Это даже не требует нового метода. Так называемый «метод гибридизационного захвата» предлагает все необходимое. Что требуется, так это обращать внимание при последующем анализе данных.
Докторант Гринвуда Кириакос Цангарас обнаружил дополнительную ценность гибридизационного захвата случайно. Эта технология основана на крошечных магнитных шариках с прикрепленными к ним короткими последовательностями из нескольких пар оснований (олигонуклеотидов, или коротко олигонуклеотидов). Как только эти подготовленные шарики добавляются к образцу смеси одноцепочечных фрагментов ДНК, только целевые комплементарные последовательности связываются с олигонуклеотидами, и создаются короткие двухцепочечные фрагменты ДНК. Гранулы удаляются с образца с помощью магнита, а отслоившиеся фрагменты смываются.
Затем короткие двойные нити элюируются с магнитных шариков и секвенируются.В день открытия Цангарас хотел сравнить только конкретную последовательность ДНК, заключенную в митохондриях различных грызунов из Юго-Восточной Азии.
Поэтому он использовал последовательность примерно из тысячи пар оснований для захвата соответствующей ДНК. «Да, у нас есть последовательность», — сказал он Гринвуду. "Но у нас также есть намного больше!"Анализ последовательностей и сравнение со справочными данными показали, что полный митохондриальный геном грызунов был извлечен из «пула ДНК». «В этом нет никакого смысла», — подумал Гринвудс. Однако контрольные эксперименты привели к такому же интригующему результату.
Гринвуд попросил Тома Гилберта из Центра геогенетики в Копенгагене помочь проанализировать это явление. Рассмотрев несколько гипотез, они вернулись к наиболее очевидному объяснению — должна была быть цепная реакция.
Образно говоря, целевая последовательность первой попала на приманку — комплементарная олигонуклеотидная последовательность, связанная с приманкой на магнитной бусине. Затем вторая последовательность прикрепилась к хвосту первой, а затем хвост второй «укусил» третий и так далее ". Перед обработкой образец содержал неповрежденную двойную спираль, которая затем существовала в виде фрагментов различной длины. Поскольку одноцепочечная ДНК обладает способностью спонтанно связываться с любой подходящей комплементарной цепью, с которой она сталкивается, произошло следующее: после того, как комплементарный фрагмент из цепи A привязался к приманке, фланкирующий аналог из цепи B привязался к ее выступающему концу.
Затем последовал еще один фрагмент из A, затем из B, затем из A… и так далее.Это довольно просто и совместимо с учебными знаниями. Почему этого раньше никто не наблюдал? «Если кто-то ищет только тысячу пар оснований, он обычно только проверяет, нашел ли он их. Все, что встречается дополнительно, считается мусором», — говорит Гринвуд.
Авторы называют этот процесс «прилова», при котором один фрагмент ДНК улавливает перекрывающиеся фланкирующие последовательности, «CapFlank». Следовательно, можно получить много генетической информации с помощью всего лишь крошечного фрагмента. Фактически, полные митохондриальные геномы и почти вся последовательность генома бактерии были получены при специальном тестировании на эффективность принципа прилова.CapFlank открывает двери совершенно новым возможностям, например, в генетическом анализе возбудителей болезней. «Мы можем использовать короткие сохраненные генные последовательности, чтобы получить геном (или, по крайней мере, большие его участки), например, из патогенных вариантов вирусов гриппа или из совершенно новых патогенов», — объясняет Гринвуд.
В качестве следующей задачи его команда хочет получить простые и хорошо изученные ДНК-вирусы, такие как вирус слоновьего герпеса.Метод CapFlank подходит даже для сильно фрагментированной «древней ДНК», извлеченной из костей животных из музейных коллекций. Эти кости часто сильно загрязнены микробной или человеческой ДНК.
Коллеги Гринвуда успешно применили CapFlank к образцам коал, хранящимся в музеях. CapFlank наиболее эффективен, хотя и со свежей ДНК.
Из кишечной бактерии Escherichia coli, содержащейся в образце мочи человека, ученые за один прием извлекли 90 процентов генома.