Новая стратегия основана на человеческих РНК-связывающих белках, которые обычно помогают направлять эмбриональное развитие. Исследовательская группа адаптировала белки так, чтобы их можно было легко нацелить на желаемые последовательности РНК.«Эти белки можно использовать, например, для измерения генерации РНК или трансляции РНК в белки», — говорит Эдвард Бойден, доцент кафедры биологической инженерии, мозга и когнитивных наук в MIT Media Lab. «Это может иметь широкое применение в биологии и биоинженерии».В отличие от предыдущих попыток контролировать РНК с помощью белков, новая система MIT состоит из модульных компонентов, которые, по мнению исследователей, упростят выполнение широкого спектра манипуляций с РНК.
«Модульность — один из основных принципов проектирования в инженерии. Если вы можете делать вещи из повторяемых частей, вам не нужно мучиться над дизайном. Вы просто строите вещи из предсказуемых, связываемых единиц», — говорит Бойден, также является членом Института исследований мозга Макговерна Массачусетского технологического института.
Бойден — старший автор статьи, описывающей новую систему, в Трудах Национальной академии наук. Ведущими авторами статьи являются постдок Катаржина Адамала и аспирант Даниэль Мартин-Аларкон.
Модульный кодЖивые клетки содержат много типов РНК, которые выполняют разные роли.
Одна из наиболее известных разновидностей — это информационная РНК (мРНК), которая копируется из ДНК и несет информацию, кодирующую белок, в клеточные структуры, называемые рибосомами, где мРНК направляет сборку белка в процессе, называемом трансляцией. Мониторинг мРНК может многое рассказать ученым о том, какие гены экспрессируются в клетке, а настройка трансляции мРНК позволит им изменять экспрессию генов без необходимости изменять ДНК клетки.Чтобы добиться этого, команда Массачусетского технологического института намеревалась адаптировать встречающиеся в природе белки, называемые доменами гомологии Pumilio. Эти связывающие РНК белки включают последовательности аминокислот, которые связываются с одним из рибонуклеотидных оснований или «буквами», составляющими последовательности РНК — аденином (A), тимином (T), урацилом (U) и гуанином (G).
В последние годы ученые работали над разработкой этих белков для экспериментального использования, но до сих пор создание белков, которые связывались с определенной последовательностью РНК, было скорее методом проб и ошибок.«Это не был действительно модульный код», — говорит Бойден, имея в виду аминокислотные последовательности белка. «Вам все равно приходилось настраивать его в каждом конкретном случае. В то время как теперь, имея последовательность РНК, вы можете указать на бумаге белок, нацеленный на нее».
Чтобы создать свой код, исследователи проверили множество комбинаций аминокислот и нашли определенный набор аминокислот, которые будут связывать каждое из четырех оснований в любом положении в целевой последовательности. Используя эту систему, которую они назвали Pumby (для сборки на основе Pumilio), исследователи эффективно нацелены на последовательности РНК, длина которых варьируется от шести до 18 оснований.РНК манипуляцииВ экспериментах на человеческих клетках, выращенных в лабораторной посуде, исследователи показали, что они могут точно маркировать молекулы мРНК и определять, как часто они переводятся.
Во-первых, они разработали два белка Памби, которые будут связываться с соседними последовательностями РНК. Каждый белок также прикреплен к половине молекулы зеленого флуоресцентного белка (GFP). Когда оба белка находят свою последовательность-мишень, молекулы GFP соединяются и становятся флуоресцентными — это сигнал исследователям о наличии целевой РНК.
Кроме того, команда обнаружила, что каждый раз, когда молекула мРНК транслируется, GFP отключается, а когда трансляция завершается, с ней связывается другой GFP, усиливая общий флуоресцентный сигнал. Это позволяет исследователям рассчитать, как часто читается мРНК.Эта система также может использоваться для стимуляции трансляции целевой мРНК. Для этого исследователи прикрепили белок, называемый инициатором трансляции, к белку Памби.
Это позволило им резко увеличить трансляцию молекулы мРНК, которая обычно не читается часто.«Мы можем включить трансляцию произвольных генов в клетке, вообще не модифицируя геном», — говорит Мартин-Аларкон.
В настоящее время исследователи работают над использованием этой системы для маркировки различных молекул мРНК внутри нейронов, что позволяет им проверить идею о том, что мРНК для разных генов хранятся в разных частях нейрона, помогая клетке оставаться готовой к выполнению таких функций, как хранение новых воспоминания. «До сих пор было очень трудно наблюдать за тем, что происходит с этими мРНК, или контролировать их», — говорит Бойден.Эти связывающие РНК белки можно также использовать для построения молекулярных сборочных линий, которые будут объединять ферменты, необходимые для выполнения ряда реакций, которые производят лекарство или другую интересующую молекулу.