Используя технологию «световой микроскопии», изобретенную и разработанную профессором Эрнстом Штельцером, уже можно было очень точно и наглядно наблюдать организмы во время дифференцировки клеток. Его группа в Университете Гете во Франкфурте теперь объединила световые листы с техникой, которая до сих пор позволяла только очень высокое пространственное разрешение (
Флуоресцентная микроскопия на основе световых пластинок (LSFM) — новейший метод трехмерной флуоресцентной микроскопии. В флуоресцентной микроскопии часть молекул клетки маркируется флуоресцентными маркерами, которые освещаются лучом света.
Камера записывает трехмерное распределение флуоресцирующих молекул, i.е. флуорофоры. Выдающимся преимуществом LSFM является то, что даже чувствительные образцы, такие как эмбрионы рыб, выживают при наблюдении. Это большое достижение, поскольку традиционные методы, которые освещают весь образец, подвергают образцы гораздо большему воздействию энергии и разрушают клетки за очень короткий период времени.
Эрнст Стельцер, профессор Института клеточной биологии и нейробиологии и главный исследователь в кластере передовых технологий «Макромолекулярные комплексы» Университета Гете во Франкфурте, объясняет, что LSFM освещает не весь образец, а только световые листы микрометровой толщины. «Поскольку мы исследуем биологические образцы в максимально естественных условиях, мы достигаем очень точных результатов», — говорит Штельцер.
Однако не только статические изображения клеток, но и динамические изменения в их среде обитания или генетические мутации могут быть измерены при прямом сравнении.
Бо-Жуй Чанг, Виктор Перес Меза и Эрнст Стельцер усовершенствовали эту технику: «Мы объединили световую флуоресцентную микроскопию с микроскопией с когерентным структурированным освещением (SIM).
Это обеспечивает чрезвычайно высокое разрешение », — сообщает он. SIM — это метод сверхвысокого разрешения, позволяющий создавать несколько изображений, которые объединяются в цифровом виде. В результате разрешение улучшается в физическом смысле. Технический подход заключается в возбуждении флуоресцирующего образца очень специфическим рисунком освещения.
Разрешение менее 100 нм с помощью этого метода ограничивается поверхностями, но у этого метода есть основные преимущества. Он довольно умеренно возбуждает флуоресценцию, позволяет очень быстро получать изображения и может использоваться со всеми флуоресцирующими молекулами для целей высокого разрешения.
«В новом микроскопе, который мы называем csiLSFM, мы усовершенствовали принцип SIM таким образом, что разрешение менее 100 нм больше не ограничивается поверхностями, но может также использоваться для обширных трехмерных объектов.
Здесь два встречных световых листа интерферируют под углом 180 °, так что они образуют минимально возможную линейную интерференционную картину. В результате мы достигаем оптимального разрешения менее 100 нанометров », — поясняет Эрнст Стельцер. Новый прибор имеет три линзы объектива. Он работает за счет гибкого управления вращением, частотой и фазовым сдвигом идеально модулированного светового полотна.
Изображения эндоплазматического ретикулума дрожжей, сложной мембранной сети канальцев, пузырьков и цистерн, показывают, что исследователи могут использовать csiLSFM для успешной работы с физиологически важными объектами.