CRISPR-Cas9 — исключительный инструмент, но технология не идеальна. При использовании он иногда производит вставки и удаления, известные как отступы, на непреднамеренно нецелевых сайтах.
Поскольку непреднамеренное расщепление гена может привести к неожиданной мутации, очень важно обнаруживать любые ошибки в процессе CRISPR-Cas9. 19 января в Genome Research команда Кима из IBS представила инструмент, который они назвали мультиплексным Digenome-seq (расщепленное секвенирование генома), который может отображать геномные специфичности нескольких нуклеаз CRISPR-Cas9 одновременно для обнаружения как преднамеренных, так и нежелательных индельсы быстро и дешево.Первый автор Даесик Ким объясняет, что «Digenome-seq отличается от других клеточных методов тем, что он обнаруживает расщепления ДНК in vitro, а не в клетках, используя внеклеточную геномную ДНК». Преимущество использования внеклеточной ДНК заключается в том, что она дает точные результаты анализа, поскольку хроматин, который обычно находится в клетке, не мешает процессу.
Кроме того, поскольку рассматриваемая ДНК не нуждается в массовой амплификации с помощью ПЦР перед исследованием; Digenome-seq проще, быстрее и дешевле в использовании, чем предыдущие методы. Digenome-seq работает путем комбинирования внеклеточной целевой ДНК с белком Cas9 и sgRNA (единственная направляющая РНК) in vitro.
SgRNA приводит Cas9 к целевому и нецелевому участку ДНК, где он расщепляется эндонуклеазой Cas9. В ходе исследования исследователи определили целевые и нецелевые сайты, расщепленные in vitro, и измерили частоту инделений в сотнях нецелевых сайтов в клетках, которые потенциально могут стать непреднамеренными мутациями.
Затем их точность оценивается с помощью системы, разработанной командой IBS, которая называется OTI (индекс нецелевого эффекта), которая сравнивает соотношение частот отклонения от цели и частоты попадания в цель.В отличие от ранее использовавшихся моноплексных процессов, которые могут работать только с одной sgRNA за раз, мультиплексный Digenome-seq выполняет одновременный анализ множества sgRNA для одновременного обнаружения всех их целевых и нецелевых сайтов.
Этот процесс мультиплексирования быстрее, эффективнее и экономичнее, чем предыдущие методы. В дополнение к своей скорости Digenome-seq способен обнаруживать больше отступов вне цели, чем другие методы, такие как HTGTS или Guide-seq.
Директор IBS Джин-Су Ким сказал, что «CRISPR-Cas9 — это невероятный научный прорыв, который и впредь будет в центре внимания биологов всего мира». Он добавил, что «эту технику можно использовать для выбора целевых сайтов с наименьшими побочными эффектами — метод, необходимый для терапевтического применения CRISPR-Cas9».
Обладая превосходной точностью, экономией средств и скоростью, мультиплексный Digenome-Seq, по-видимому, является новым стандартом для тестирования специфичности CRISPR-Cas9.