«Наши результаты раскрывают две основные функции PAM, которые объясняют, почему он так важен для способности Cas9 нацеливать и расщеплять последовательности ДНК, соответствующие направляющей РНК», — говорит Дженнифер Дудна, биохимик, возглавлявший это исследование. «Присутствие PAM рядом с сайтами-мишенями в чужеродной ДНК и его отсутствие в этих мишенях в геноме хозяина позволяет Cas9 точно различать чужеродную ДНК, которая должна быть деградирована, и собственную ДНК, которая может быть почти идентична. PAM также необходим для активации фермента Cas9 ».Поскольку генно-инженерные микроорганизмы, такие как бактерии и грибы, играют все более важную роль в зеленой химии, производящей ценные химические продукты, включая терапевтические лекарства, передовое биотопливо и биоразлагаемые пластмассы из возобновляемых источников, Cas9 становится важным инструментом редактирования генома для специалистов, занимающихся синтетическими технологиями. биология.
«Понимание того, как Cas9 может находить конкретные целевые последовательности из 20 пар оснований в геномах, длина которых составляет от миллионов до миллиардов пар оснований, может помочь улучшить нацеливание генов и усилия по редактированию генома в бактериях и других типах клеток», — говорит Дудна, который придерживается совместные приемы с отделом физических биологических наук Berkeley Lab и отделом молекулярной и клеточной биологии и отделением химии Калифорнийского университета в Беркли, а также является исследователем в Медицинском институте Говарда Хьюза (HHMI).Дудна — один из двух авторов статьи, описывающей это исследование, в журнале Nature. Документ озаглавлен «Исследование ДНК с помощью CRISPR-управляемой РНК-эндонуклеазы Cas9».
Другой автор-корреспондент — Эрик Грин из Колумбийского университета. Соавторами этой статьи были Сэмюэл Стернберг, Сай Реддинг и Мартин Джинек.
Бактериальные микробы сталкиваются с нескончаемым натиском вирусов и инвазивных фрагментов нуклеиновых кислот, известных как плазмиды. Чтобы выжить, микробы используют адаптивную иммунную систему, основанную на нуклеиновых кислотах, которая вращается вокруг генетического элемента, известного как CRISPR, что означает кластерные регулярные короткие палиндромные повторы. Благодаря комбинации CRISPR и РНК-управляемых эндонуклеаз, таких как Cas9 («Cas» означает CRISPR-связанный), бактерии могут использовать небольшие индивидуализированные молекулы crRNA (для CRISPR-РНК), чтобы направлять нацеливание и деградацию совпадающих последовательностей ДНК. во вторжении вирусов и плазмид, чтобы предотвратить их репликацию.
Существует три различных типа систем иммунитета CRISPR-Cas. Дудна и ее исследовательская группа сосредоточились на системе типа II, которая полагается исключительно на запрограммированный РНК Cas9 для расщепления двухцепочечной ДНК в сайтах-мишенях.«Главной загадкой в ??области CRISPR-Cas было то, как Cas9 и подобные комплексы, управляемые РНК, обнаруживают и распознают совпадающие ДНК-мишени в контексте всего генома, классическая проблема с иголкой в ??стоге сена», — говорит Сэмюэл Стернберг, руководитель автор статьи Nature и член исследовательской группы Дудны. «Все ученые, которые разрабатывают программируемый с помощью РНК Cas9 для геномной инженерии, полагаются на его способность воздействовать на уникальные последовательности длиной 20 пар оснований внутри клетки.
Однако, если бы Cas9 просто слепо связывал ДНК в случайных участках генома пока не столкнется со своей целью, этот процесс будет невероятно трудоемким и, вероятно, слишком неэффективным, чтобы быть эффективным для бактериального иммунитета или в качестве инструмента для инженеров генома. Наше исследование показывает, что Cas9 ограничивает свой поиск, сначала ища последовательности PAM.
Это ускоряет скорость, с которой может быть обнаружена цель, и сводит к минимуму время, затрачиваемое на опрос нецелевых участков ДНК ».Дудна, Штернберг и их коллеги использовали уникальный анализ ДНК-завес и флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIRFM) для визуализации отдельных молекул Cas9 в реальном времени, когда они связываются с ДНК и исследуют ее. Технология занавесей ДНК предоставила беспрецедентное понимание механизма процесса поиска цели Cas9. Результаты визуализации были проверены с использованием традиционных биохимических анализов.
«Мы обнаружили, что Cas9 опрашивает ДНК на предмет соответствия последовательности, используя спаривание оснований РНК-ДНК только после распознавания PAM, что позволяет избежать случайного нацеливания на совпадающие сайты в собственном геноме бактерии», — говорит Штернберг. «Однако, даже если Cas9 каким-то образом ошибочно связывается с соответствующей последовательностью в собственном геноме, каталитическая нуклеазная активность не запускается без присутствия PAM. Благодаря этому механизму опроса ДНК, PAM обеспечивает две избыточные контрольные точки, которые гарантируют, что Cas9 может». t по ошибке уничтожить собственную геномную ДНК ".Примечание.
Обучающее видео с описанием исследования доступно по адресу: http://www.youtube.com/watch?v=M739wgbcKuA.