Новый метод, описанный 2 июля 2015 года в журнале Cell, позволяет исследователям нанести на карту важные химические метки, называемые фосфатами, которые связываются с аминокислотами (строительными блоками белков) на последних этапах создания белка.Когда клетка производит белок, молекулярные синтетические механизмы сначала соединяют аминокислоты в длинную нить, которая изгибается и складывается по мере удлинения. Затем ферменты собираются вокруг структуры, чтобы внести последние изменения — обрезать белок или добавить химические метки. Среди этих последних модификаций — фосфорилирование — или добавление фосфата — отдельных аминокислот для изменения функции белка.
До сих пор было сложно определить, где именно (и почему) добавлены все эти фосфаты.«Мы знаем, что 9 из 20 аминокислот могут фосфорилироваться, но мы очень мало знаем о большинстве из них, потому что их так сложно изучать», — говорит Тони Хантер, профессор Американского онкологического общества, заведующий кафедрой Дульбекко в Лаборатория молекулярной и клеточной биологии Солка и старший автор новой статьи.Когда фосфат добавляется к трем конкретным аминокислотам — серину, треонину и тирозину — он образует прочную химическую связь.
Исследователи могут легко определить местонахождение этих фосфатов. Но когда другие шесть аминокислот фосфорилируются, фосфат слабо присоединяется к каждой аминокислоте, что создает проблемы для исследователей, пытающихся понять, что происходит в этих случаях.
Одна из этих аминокислот, называемая гистидином (или фосфогистидином после добавления фосфата), была особенно сложной для изучения.«С помощью этих событий сильного фосфорилирования вы можете пометить клетки, выделить белки и проанализировать белки различными способами, чтобы выяснить, где находятся фосфаты», — говорит Хантер. «Вы не можете сделать это с фосфогистидином, потому что он настолько нестабилен, что разваливается, когда вы пытаетесь изолировать белки».Хантер и его сотрудники поняли, что для изучения этого нестабильного взаимодействия им придется использовать трюк, чтобы укрепить связь между фосфатом и гистидином.
Поэтому они использовали особый вид модифицированного фосфата, называемый фосфонатом, созданный для более плотного связывания с любым из двух участков аминокислоты гистидина, куда может быть добавлен фосфат. Затем они разработали антитела, которые специфически распознают эти стабильные аналоги фосфогистидина, но также обнаруживают аутентичный фосфогистидин в белках.Чтобы протестировать эти новые инструменты, команда добавила свои фосфогистидиновые антитела к коллекции различных клеток млекопитающих, выращенных на слайдах, и наблюдала, где в клетке связываются антитела, что указывает на части клеток, которые имеют высокий уровень белков с фосфогистидинами.«Что нас больше всего удивило, так это то, что когда мы окрашивали клетки новыми антителами, мы видели отдельные области внутри клеток, которые имели высокий уровень фосфорилирования гистидина, особенно когда они подвергались митозу, стадии, на которой клетки делятся на две дочерние клетки ", — говорит Хантер.
Они еще не знают, почему это так, но планируют продолжить изучение этих результатов, а также обнаружение фосфорилирования других аминокислот.Команда ожидает, что эти инструменты для антител будут полезны другим лабораториям, стремящимся определить, содержат ли интересующие белки какие-либо фосфогистидины.По словам Хантера, новый метод «довольно прост в использовании в любой лаборатории». «Это не требует специального инструмента или чего-то еще, поэтому я думаю, что это может быть довольно быстро принято».
Другими исследователями в исследовании были Стивен Раш Фухс, Джилл Мейзенхелдер, Аарон Асланян, Ли Ма, Анна Загорска и Грег Лемке из Института Солка; Магда Станкова, Алан Бинни, Фахад Аль-Обейди и Жак Могер из компании Санофи; и Джон Р. Йейтс III из Исследовательского института Скриппса.Работа и привлеченные исследователи были поддержаны Национальными институтами здравоохранения, инновационным грантом института Солка и Центром геномной медицины Хелмсли.