Большинство систем CRISPR / Cas9 работают, создавая «двухцепочечные разрывы» (DSB) в областях генома, предназначенных для редактирования или удаления, но многие исследователи выступают против создания таких разрывов в ДНК живых людей. В качестве доказательства концепции группа Солка использовала свой новый подход к лечению нескольких заболеваний, включая диабет, острое заболевание почек и мышечную дистрофию, на моделях мышей.
«Хотя многие исследования продемонстрировали, что CRISPR / Cas9 можно применять в качестве мощного инструмента для генной терапии, растет беспокойство по поводу нежелательных мутаций, вызванных двухцепочечными разрывами в этой технологии», — говорит Хуан Карлос Изписуа Бельмонте, профессор Солкского университета. Лаборатория экспрессии генов и старший автор новой статьи, опубликованной в Cell 7 декабря 2017 года. «Мы смогли обойти эту проблему».В исходной системе CRISPR / Cas9 фермент Cas9 связан с направляющими РНК, которые направляют его в нужное место генома для создания DSB.
Недавно некоторые исследователи начали использовать «мертвую» форму Cas9 (dCas9), которая все еще может нацеливаться на определенные места в геноме, но больше не разрезает ДНК. Вместо этого dCas9 был связан с доменами активации транскрипции — молекулярными переключателями, которые включают гены-мишени. Но полученный в результате белок — dCas9, прикрепленный к переключателям-активатору — слишком велик и громоздок, чтобы поместиться в транспортном средстве, обычно используемом для доставки таких видов терапии к клеткам живых организмов, а именно к аденоассоциированным вирусам (AAV). Отсутствие эффективной системы доставки очень затрудняет использование этого инструмента в клинических приложениях.
Команда Изписуа Бельмонте объединила Cas9 / dCas9 с рядом различных переключателей-активаторов, чтобы раскрыть комбинацию, которая работала даже тогда, когда белки не были слиты друг с другом. Другими словами, Cas9 или dCas9 были упакованы в один AAV, а переключатели и направляющие РНК были упакованы в другой.
Они также оптимизировали направляющие РНК, чтобы убедиться, что все части оказались в нужном месте в геноме, и что целевой ген был сильно активирован.«Все компоненты работают вместе в организме, чтобы влиять на эндогенные гены», — говорит Синь-Кай (Кен) Ляо, штатный исследователь лаборатории Изписуа Бельмонте и соавтор новой статьи. Таким образом, технология действует эпигенетически, то есть влияет на активность генов без изменения последовательности ДНК.Чтобы протестировать метод, исследователи использовали мышиные модели острого повреждения почек, диабета 1 типа и одной из форм мышечной дистрофии.
В каждом случае они сконструировали свою систему CRISPR / Cas9 для повышения экспрессии эндогенного гена, который потенциально может обратить вспять симптомы болезни. В случае заболевания почек они активировали два гена, которые, как известно, участвуют в функции почек, и наблюдали не только повышение уровня белков, связанных с этими генами, но и улучшение функции почек после острого повреждения. В отношении диабета 1 типа они стремились повысить активность генов, которые могут генерировать клетки, продуцирующие инсулин. И снова лечение сработало, снизив уровень глюкозы в крови у мышей с диабетом.
Что касается мышечной дистрофии, исследователи выделили гены, которые, как было ранее показано, обращают вспять симптомы болезни, включая один особенно большой ген, который не может быть легко доставлен с помощью традиционных методов лечения генов, опосредованных вирусами.«Мы были очень взволнованы, когда увидели результаты на мышах», — добавляет Фумиюки Хатанака, научный сотрудник лаборатории и соавтор статьи. «Мы можем вызвать активацию генов и в то же время увидеть физиологические изменения».Команда Изписуа Бельмонте в настоящее время работает над улучшением специфичности своей системы и применением ее к большему количеству типов клеток и органов для лечения более широкого спектра заболеваний человека, а также для омоложения определенных органов и обращения вспять процесса старения и возрастных состояний. такие как потеря слуха и дегенерация желтого пятна.
По их словам, перед испытаниями на людях потребуются дополнительные тесты на безопасность.