Хотя CRISPR-Cas9 привлек внимание всего мира из-за его способности исправлять простые наследственные заболевания у людей, основные исследователи воодушевлены его способностью помочь им понять причины и разработать методы лечения более сложных заболеваний, включая рак и деменцию.Для этого им нужно выбить или изменить определенные гены у лабораторных животных, в частности мышей, и посмотреть, что пойдет не так.
Сегодняшний золотой стандарт для создания этих «нокаутов» или «нокаутов» — это редактирование генов внутри эмбриональных стволовых клеток мыши, использование этих клеток для создания мозаичных мышей, а затем скрещивание мышей для получения чистой генетической линии. Благодаря способности CRISPR-Cas9 точно изменять или заменять гены, редактирование все чаще выполняется непосредственно в оплодотворенной яйцеклетке или раннем эмбрионе.Новый метод, получивший название CRISPR-EZ (CRISPR RNP электропорация зигот), еще больше упрощает редактирование генома эмбрионов мыши.
«Ключевые фундаментальные идеи о биологической значимости гена обычно приходят из исследований редактирования генов in vivo, в которых вы создаете мышей с измененным геном», — сказал ведущий исследователь Лин Хе, доцент кафедры молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли. «Но это серьезное обязательство — сделать новый нокаут с помощью геномной инженерии. Я думаю, что эта технология может значительно снизить технический барьер для такого рода усилий и позволит людям больше сосредоточиться на науке, а не на генетическом процессе. инженерные мыши ".Новый метод, описанный в выпуске «Журнала биологической химии» на этой неделе, позволяет обойти трудоемкое препятствие при создании мышей с нокаутом: использование микроскопических игл для введения молекул, редактирующих ген, в оплодотворенную яйцеклетку.Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли обнаружили, что простой лабораторный метод, называемый электропорацией, работает намного лучше, позволяя им вставлять молекулы, редактирующие ген CRISPR-Cas9, в эмбрионы с почти 100-процентным успехом.
Электропорация использует разряд электричества для создания в эмбрионах отверстий, через которые могут проникать молекулы.Используя CRISPR-EZ в пилотном эксперименте, команда Хэ успешно разрушила обе копии целевого гена у 88 процентов мышей. В результате процедуры было получено гораздо большее количество отредактированных мышей по сравнению с микроинъекцией CRISPR, в основном из-за значительного улучшения жизнеспособности эмбрионов.
По его словам, CRISPR-EZ — это простая и экономичная методология, которая может быть выполнена на многих эмбрионах одновременно и занимает всего миллисекунды.«В недалеком прошлом на создание нокаутной мыши требовалось не менее 25 000 долларов, а создание нокаутной мыши занимало не менее 6 месяцев», — сказал Рассел Вэнс, профессор молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Беркли и директор Лаборатории исследований рака, где работа с трансгенными мышами. «Благодаря CRISPR и таким усовершенствованиям, как CRISPR-EZ, затраты и время снизились как минимум в 10 раз. Эти технические инновации делают мышь еще более мощным инструментом для моделирования болезней человека».
Группа Калифорнийского университета в Беркли в настоящее время работает с несколькими предприятиями по выращиванию трансгенных мышей в надежде, что они примут и улучшат эту технику электропорации, которая, как она подозревает, также упростит создание других трансгенных млекопитающих.Нокауты требуют команды ЭКО
Создание трансгенных мышей требует квалифицированной команды по оплодотворению in vitro. Техники используют гормональные инъекции, чтобы подготовить самок к спариванию, после чего они собирают оплодотворенные яйца и, прежде чем яйца начнут делиться, вводят их по одной с помощью тонкой иглы. В настоящее время техники вводят две молекулы РНК — информационную РНК (мРНК), которая кодирует белок Cas9, и направляющую РНК, которая обеспечивает адрес для мишени CRISPR-Cas9, и надеются, что мРНК правильно транслируется в белок Cas9 и что белок правильно сочетается с направляющей РНК.Сконструированные эмбрионы имплантируются ложно беременной мыши, где они вынашивают в течение примерно 20 дней до рождения.
По его словам, с учетом неизбежной гибели эмбрионов во время инъекции и невозможности имплантации или доношения эмбрионов уровень живорождения низкий.«Фактический процент живорождений от инъецированных эмбрионов составляет от 10 до 15 процентов для большинства трансгенных учреждений, что является проблемой для процедуры», — сказала она. «Иногда люди собирают более 100 эмбрионов, чтобы получить одну или двух мышей с желаемым редактированием генов».Электропорация, по-видимому, наносит меньший вред эмбрионам, чем микроинъекция: от 30 до 50 процентов эмбрионов рождаются живыми.
По-видимому, также вставка предварительно собранных молекул CRISPR-Cas9 в оплодотворенную яйцеклетку является более эффективным способом редактирования генов, чем инъекция двух молекул — мРНК и направляющей РНК — в надежде, что они правильно самоорганизуются. Из числа живорожденных у 88 процентов мышей были отредактированы обе копии целевого гена — более высокий показатель успеха, чем обычно для трансгенных процедур, сказал он.Для более сложной процедуры — модификации короткой последовательности ДНК в гене — метод был успешным в 42 процентах случаев в пилотных экспериментах.
«Имея такой высокий уровень успеха, вы можете использовать это для очень быстрого тестирования ваших направляющих РНК», — сказала она. «Если ваш CRISPR-EZ не работает, это не из-за доставки; скорее всего, потому, что ваш дизайн направляющей РНК нуждается в улучшении».Высокая жизнеспособность эмбрионов и очень высокая эффективность редактирования генов означают, что исследователям нужно использовать меньше мышей и проводить несколько трансгенных экспериментов одновременно.Случайное открытие
В своей лаборатории он изучает небольшие кусочки РНК, называемые микроРНК, которые изменяют способ транскрибирования ДНК и, таким образом, контролируют важные процессы внутри клетки. Некоторые типы рака связаны с проблемами с miRNA.В поисках более простого способа создания трансгенных мышей для изучения этих регуляторных процессов научный сотрудник Эндрю Модзелевски протестировал электропорацию, чтобы увидеть, сможет ли он заставить яйца легче поглощать мРНК Cas9 и направляющую РНК. Несмотря на очевидный успех других исследователей с мРНК, его первые попытки не увенчались успехом.
Однажды вечером, обнаружив, что у него нет мРНК и не желая тратить зря подготовленные эмбрионы, он позаимствовал белок CRISPR-Cas9 из соседней лаборатории, собрал комплексы RNP и вместо этого электропорировал их.«С тех пор это работает как по волшебству», — сказал он. «Вы бы никогда не подумали, что это сработает, потому что Cas9 — гигантская молекула. ??Я был удивлен, что такой огромный белок может быть эффективно электропорирован».
По ее прогнозам, хотя в большинстве университетов есть трансгенные лаборатории, в которых выполняются микроинъекции, электропорация упрощает процедуру настолько, что отдельные лаборатории могут в конечном итоге сделать это сами.