«Разработка вариантов Cas9 с более широким диапазоном нацеливания особенно важна для приложений, требующих точного нацеливания на геномные последовательности», — говорит Бенджамин Кляйнстивер, доктор философии, научный сотрудник отдела молекулярной патологии MGH и ведущий и соавтор-корреспондент журнала Nature Biotechnology. бумага. «Кроме того, кодирующая последовательность SaCas9 на 23 процента меньше, чем у SpCas9 — версии, полученной из Streptococcus pyogenes — разница в размерах, которая делает SaCas9 выгодным для потенциальных терапевтических приложений, требующих доставки с помощью вирусов».Нуклеазы CRISPR-Cas9 состоят из короткой молекулы РНК, 20 нуклеотидов из которых соответствуют последовательности ДНК-мишени, и бактериального фермента Cas9, который разрезает ДНК в желаемом месте. Наряду с соответствием между последовательностями РНК и ДНК, Cas9 должен распознавать соседнюю нуклеотидную последовательность, называемую смежным мотивом протоспейсера (PAM). В предыдущем исследовании, опубликованном ранее в этом году в журнале Nature, команда MGH описала генетическую систему, которая позволила им быстро развить SpCas9 для распознавания различных последовательностей PAM.
Хотя встречающийся в природе SpCas9 распознает последовательность PAM в форме NGG — в которой N означает любой нуклеотид, а G — молекулу гуанина, — команда MGH смогла разработать версии SpCas9, которые распознают более широкий диапазон последовательностей PAM, по существу удваивая диапазон целевых сайтов.В своем текущем исследовании команда MGH обратилась к SaCas9, который, естественно, требует последовательности PAM NNGRRT, в которой R может быть либо аденином, либо гуанином, а T должен быть тимином, рядом с его целевой ДНК. Используя усовершенствованную форму системы молекулярной эволюции, описанной в предыдущем отчете, команде MGH удалось разработать вариант, который они называют KKH SaCas9, который распознает последовательности PAM с любым нуклеотидом в третьем положении, увеличивая диапазон их нацеливания в два-четыре раза. Система смогла спроектировать эти изменения в специфичности PAM, не требуя предварительных знаний о точной структуре фермента SaCas9, что было неизвестно во время проведения этого исследования.
«Теперь мы показали, что наш подход направленной эволюции может быть использован для изменения PAM-специфичности SaCas9, значительно увеличивая количество геномных сайтов, к которым может получить доступ эта важная нуклеаза Cas9», — говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицинских наук, ассоциированный специалист. заведующий отделом патологии MGH и соавтор статьи Nature Biotechnology. «Способность точно нацеливать сайты важна для исследователей, заинтересованных в разрушении небольших генетических элементов или проведении исследований, включающих восстановление ДНК путем гомологичной рекомбинации, обмена нуклеотидами между цепями ДНК, что лучше всего может быть достигнуто, когда разрыв ДНК находится близко к месту разрыва.
Мы считаем, что наш подход к направленной эволюции представляет собой важный план для изменения свойств распознавания множества нуклеаз Cas9, которые существуют во многих бактериях ». Джунг — профессор патологии Гарвардской медицинской школы.