«Мы мало знаем о деталях того, как комплекс CRISPR-Cas9 обходит геном живой клетки и находит свою цель», — сказал Тору Педерсон, доктор философии, профессор клеточной биологии Витольда Арнетта и профессор биохимии и молекулярной биологии. фармакология. «То, что мы узнали в этом исследовании о том, как работает этот механизм, важно и полезно для редакторов генов, которые хотят разработать инструменты для лаборатории и, возможно, клиники».Компонент бактериальной иммунной системы, который защищает ее от вирусного вторжения, комплекс CRISPR-Cas9 представляет собой мощную систему редактирования генов. Более эффективный и точный, чем предыдущие технологии, комплекс CRIPR-Cas9 адаптируется в лаборатории, поскольку ученые находят способы его программирования и быстрой доставки, чтобы выборочно редактировать определенные генетические последовательности для изучения. Чтобы разрезать кусок двухцепочечной ДНК, CRISPR-Cas9 использует направляющую РНК, состоящую примерно из 20 нуклеотидов, для нацеливания на определенные области генома, в которых комплекс Cas9 затем делает разрез.
Это позволяет ученым удалять или вставлять генетические последовательности в геном.Поскольку основная динамика того, как система CRISPR / Cas9 работает внутри живых клеток, не совсем понятна, некоторые системы и методы доставки оказались более успешными, чем другие. Чтобы наблюдать за действиями системы CRISPR-Cas9 в живой клетке, доктор Педерсон и его коллеги разработали метод маркировки направляющей РНК и элементов Cas9 разными флуоресцентными молекулами, чтобы их можно было отслеживать одновременно.Они обнаружили, что направляющая РНК, когда она не связана с Cas9, очень недолговечна.
Когда Cas9 и направляющая РНК действительно собираются, комплекс становится намного более стабильным, причем примерно половина из них показывает время жизни в ядре клетки приблизительно 15 минут, а оставшаяся часть является значительно более стабильной.«Cas9 стабилизирует направляющую РНК», — сказал Ханхуэй Ма, доктор философии, исследователь лаборатории Pederson и соавтор статьи в Journal of Cell Biology. «Если вы доставляете направляющую РНК и Cas9 отдельно в клетку для их последующей сборки, это будет не так эффективно, потому что некоторая направляющая РНК будет деградировать.
Если вы доставите их обе в клетку уже собранными, вы» увижу больше активности ".Другое наблюдение, сделанное командой, в которую входили Дэвид Грюнвальд, доктор философии, доцент Института терапии РНК, и Ли-Чун Ту, доктор философии, научный сотрудник лаборатории Грюнвальда, заключалось в том, что продолжительность пребывания цели РНК-комплексом Cas9-guide определяет, будет ли разрезана ДНК. Когда последовательность направляющей РНК полностью совпадала с последовательностью ДНК-мишени, комплекс Cas9-направляющая РНК оставался связанным в течение двух часов перед уходом с завершением расщепления.
При несовпадении направляющих последовательностей ДНК РНК-мишени комплекс сохранялся всего на несколько минут, и расщепление нарушалось.Зная это, ученые потенциально могут математически предсказать, где может произойти срезание вне цели, исходя из того, как долго комплекс CRISPR находится в геноме, сказал Ма.«Мы до сих пор не знаем правил CRISPR, — сказал доктор Ма. «Все хотят знать, что произойдет, когда он будет доставлен в живую клетку.
Это исследование помогает написать отрывок из этого руководства по эксплуатации».