В то время как многие исследователи вирусов заинтересованы в понимании того, что заставляет эти спящие вирусы просыпаться или реактивироваться, ученые из Принстона пытаются понять, что в первую очередь мешает инфекции уснуть.Чтобы выяснить, как герпес-вирусные инфекции затихают и что запускает молчание, несколько исследователей попытались создать упрощенные модельные системы in vitro с использованием нейрональных клеток, которые культивируются в чашках Петри и инфицированы вирусами.К сожалению, вирусные инфекции in vitro почти всегда находятся в продуктивной фазе — бодрствовании — поэтому, чтобы вызвать латентный период, исследователи использовали суровые методы, объяснила Оркид Озге Коюнку, младший научный сотрудник в области молекулярной биологии.
Типичный подход требует диссоциации клеток-мишеней и дозирования им интерферона или ингибитора репликации до заражения вирусом.В процессе изучения сна это похоже на то, что ваши испытуемые бьют дубинками, а затем надеются, что тела на полу проснутся нормально.
Но Коюнку нашла более мягкий подход — больше похожий на пение им колыбельной — который позволил ей усыпить вирусы в культивируемых нейронах без использования каких-либо ингибиторов.Вместе со своими коллегами Маргарет Макгибени, доктором медицинских наук. Студент, тогда занимавший постдокторский исследователь Ян Хог, и Линн Энквист, главный исследователь лаборатории и профессор молекулярной биологии Генри Л. Хиллмана, Коюнку использовал эту уникальную систему модели латентности для выявления конкретных клеточных и вирусных компонентов, которые могут предотвратить распространение инфекции. спать.
Их результаты появляются в PLoS Pathogens.Этот новый подход «представляет собой важное достижение», — сказала Фелисия Гудрам Стерлинг, директор аспирантуры по иммунологии онкологического центра Университета Аризоны, которая не принимала участия в исследовании.
«В понимании латентности вируса герпеса все решают модельные системы, — пояснил Гудрам Стерлинг. «Важной, всеобъемлющей целью данной области является разработка систем культивирования с использованием первичных клеток с минимальными [внешними] манипуляциями ex vivo … Это первая модельная система, которая не требует лечения лекарствами для установления латентного периода».Коюнку и ее коллеги используют трехкомпонентную систему для культивирования нейронов, которая сохраняет основную структуру — «архитектуру» — нервов, на которые нацелены эти вирусы.
У людей отдельные нервы могут быть на удивление длинными, самые длинные — от пальцев ног до позвоночника. На одном конце нервы достигают клеток кожи, где они собирают сенсорную информацию, а на другом конце — тело клетки, которое содержит ядро ??и генетическую информацию нейрона. Эти тела нейронных клеток защищены глубоко внутри тела.
Между ними находится аксон, похожий на шоссе путь, по которому информация переносится туда и обратно между периферическими тканями и нервной системой.По словам Коюнку, отчасти то, что делает вирусы герпеса настолько интересными, заключается в их способности проходить через этот аксональный тракт. Заражение происходит в периферических тканях, затем вирусные частицы проникают в аксоны и проникают в отдаленное ядро ??клетки, где вирусная генетическая информация может стать скрытой, спящей в течение нескольких дней или даже лет.
Когда геномы «просыпаются», образуются новые вирусные частицы, которые могут перемещаться по аксону обратно в периферические ткани, что создает герпес, который может передавать инфекцию новым хозяевам. В редких случаях вирусные частицы могут попасть в мозг и вызвать энцефалит.
Когда нейроны диссоциированы, что до сих пор было стандартным подходом для изучения латентности, тела клеток с их аксонами перемешиваются, что делает невозможным имитацию естественного пути вторжения нервной системы через изолированные аксоны.В подходе Коюнку разделенная клеточная камера, называемая модифицированной трехкамерной камерой Кампено, позволяет исследователям разделять аксоны и клеточные тела. «Это упрощенная система», — сказала она. «Мне это нравится, потому что вы не только можете контролировать вирусную дозу, инфицирующую аксоны, но также можете контролировать каждый шаг — от транспорта в аксонах до экспрессии в ядре — с помощью микроскопии живых клеток».
Как только нейроны, посеянные на одной стороне камеры, вырастили аксоны в две другие камеры, Коюнку ввел небольшое количество вирусных частиц в изолированные аксоны. Этого шага достаточно, чтобы естественным образом усыпить инфекцию в ядрах тел клеток без необходимости в интерфероне или ингибиторах репликации вируса. Тела клеток распознают, что они инфицированы, и активируют систему защиты, чтобы заглушить поступающую вирусную генетическую информацию.
Как только инфекцию удалось убаюкивать, Коюнку занялся новым вопросом: могут ли вирусы «спастись» от этой первоначальной судьбы, заставляющей замолчать? Какие процессы или пути позволяют вирусным геномам оставаться в продуктивном режиме инфицирования, когда геномы экспрессируются и образуются вирусные белки и новые вирусные частицы?Когда вирусы герпеса проникают в нервную систему, вирусная ДНК распознается как чужеродная. Нейронные клетки отключают экспрессию вирусных генов, чтобы защитить нервную систему, но генетический материал вторгшегося вируса остается, молча ожидая в нейронах триггера, чтобы проснуться и произвести более активный вирус.
К настоящему времени Коюнку и ее коллеги определили два пути для вирусов герпеса, которым суждено заставить замолчать, чтобы избежать замалчивания: медленный путь, опосредованный стрессом, который инициируется нейроном, и быстрый путь, который активируется вирусными белками тегумента. Вирусная оболочка, также известная как вирусный матрикс, представляет собой кластер белков, выстилающих оболочку, окружающую ядро ??вируса герпеса.Медленный процесс запускается нейронами, когда хозяин испытывает стресс, например, солнечный ожог, гормональные изменения или физическую травму. Нейроны начинают вырабатывать белки, чтобы защитить себя.
Будучи убитым, нейрон не может быть заменен.Сигналы стресса пробуждают «тихую» вирусную инфекцию, которая начинает производить несколько новых вирусных белков — но этого недостаточно, чтобы считаться продуктивной инфекцией, объяснил Энквист.«Эти вирусные белки необходимы, но их недостаточно, чтобы надежно запустить продуктивную инфекцию», — сказал он. Требовалось нечто большее: быстрый процесс, открытый Коюнку и ее коллегами.
Быстрый процесс зависит от набора вирусных белков, которые, по мнению исследователей, «ускоряют» активацию скрытой вирусной информации. Коюнку обнаружила это, когда она заразила изолированные аксоны небольшим количеством вирусных частиц, которые обычно перемещаются к телам клеток и заставляют замолчать, одновременно подвергая тела клеток большому количеству инактивированных вирусных частиц, которые были дозированы ультрафиолетовым излучением ( УФ).
Это привело к тому, что на сонные вирусы вылили ведро ледяной воды, чтобы не дать им уснуть, как только они достигнут ядра.Хотя ультрафиолетовое излучение делает вирусный геном неспособным к воспроизводству, исследователи обнаружили, что этих облученных частиц, которые все еще содержат протеины тегумента и поврежденные геномы, было достаточно, чтобы вирус не спал.Это было ее первое большое "ага!" Почти два года назад Коюнку вспоминал: «Заразив клеточные тела вирусными частицами, которые были инактивированы ультрафиолетом, и одновременно заразив аксоны вирусами, которые обычно подавляются, я увидел продуктивную инфекцию за три дня — что было очень быстро. Я сказал: «Хорошо, теперь у нас есть надежная система для изучения сигналов сна / бодрствования!» »«Это было потрясающе», — сказал Энквист, — «но тогда возник вопрос:« Какие вирусные компоненты способствуют бегству от молчания? »» Одна популярная гипотеза, объяснил МакГибени, заключалась в том, что большое количество вирусных геномов могло насыщать механизм подавления звука. в ядре, по сути «подавляя защитную систему нейрона».
Но вместо этого она и Коюнку инфицировали тела клеток тем, что они назвали «легкими частицами» — вирусными частицами, которые были выдолблены, оставляя белки оболочки и тегумента, но без генома или ядра — и обнаружили, что они смогли достичь того же. убежать от молчания. «Эти эксперименты с« легкими частицами »- без геномов — предполагают, что избыточные геномы не требуются для выхода из молчания, тогда как вирусные белки-тегументы имеют решающее значение», — сказала она.Команда из Принстона также обнаружила, что, когда в теле клетки присутствуют белки-тегументы вируса, уход от молчания не требует ранее идентифицированных сигналов стресса.
Будучи студенткой-медиком, МакГибени смотрит на исследования менее теоретически, чем ее коллеги. «Если вы можете понять молекулярные механизмы, лежащие в основе того, как устанавливается латентность и как вирусные геномы могут избежать замалчивания, тогда вы можете начать идентифицировать некоторые конкретные терапевтические цели, которые мы могли бы в конечном итоге преследовать [с помощью лекарств]».Энквист согласился и подвел итоги: «Мы определили класс вирусных белков, которые усиливают стрессовую реакцию нейронов, пробуждая геномы спящего вируса герпеса».
Работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (гранты RO1 NS33506 и NS060699 для LWE) и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (стипендия F30 NS090640 для MM).