Исследование Университета Рокфеллера, описанное в журнале Nature, предлагает новое понимание таинственного процесса, с помощью которого эта система кодирует вирусную ДНК в геноме микроба для последующего использования в качестве руководства для ферментов, уничтожающих вирусы.
"Микробы, как и позвоночные, обладают иммунной системой, способной адаптироваться к новым угрозам. Cas9, один из ферментов, используемых этими системами, использует иммунологическую память, чтобы направлять сокращения вирусного генетического кода.
Однако очень мало известно о том, как эти воспоминания приобретаются в первую очередь », — говорит доцент Лучано Марраффини, руководитель лаборатории бактериологии. «Наша работа показывает, что Cas9 также управляет формированием этих воспоминаний среди определенных бактерий."
Эти воспоминания встроены в бактериальный эквивалент адаптивной иммунной системы, способной отличать полезные от вредоносных вирусов, называемой системой CRISPR (регулярно сгруппированные короткие палиндромные повторы). Он работает, изменяя геном бактерии, добавляя короткие вирусные последовательности, называемые спейсерами, между повторяющимися последовательностями ДНК.
Эти прокладки формируют воспоминания о прошлых захватчиках. Они служат проводниками для ферментов, кодируемых генами, связанными с CRISPR (Cas), которые ищут и уничтожают те же самые вирусы, если они снова попытаются заразить бактерию.
Способность Cas9 делать точные разрезы в геноме — вирусном или другом — привлекла внимание исследователей, которые теперь используют его для изменения генетики клеток в экспериментальных или терапевтических целях.
Но до сих пор не совсем понятно, как эта система CRISPR работает с естественными бактериями.
Некоторые данные свидетельствуют о том, что другие ферменты Cas управляют процессом создания памяти самостоятельно, без Cas9. Но из-за того, как Cas9 определяет место, где нужно сделать разрез, исследователи, в том числе соавторы Роберт Хелер, аспирант, и Пулами Самай, постдок в лаборатории, заподозрили роль Cas9 в памяти. изготовление.
Помимо сопоставления своей направляющей последовательности CRISPR с ДНК вируса, Cas9 необходимо найти вторую подсказку поблизости: последовательность PAM (смежный мотив протоспейсера) в вирусной ДНК.
Это важный шаг, поскольку именно отсутствие последовательности PAM предотвращает атаку Cas9 собственной ДНК бактерии, содержащей память.
«Поскольку Cas9 должен распознать последовательность PAM, прежде чем разрезать вирусную ДНК, для нас было логично, что Cas9 также распознает последовательность PAM, когда система формирует память о своей первой встрече с вирусом», — говорит Хелер. "Это новая и неожиданная роль для Cas9."
Чтобы проверить свою гипотезу, Хелер поменял местами ферменты Cas9 между иммунными системами Streptococcus pyogenes и Streptococcus thermophilus, каждая из которых распознает разные последовательности PAM. В результате последовали последовательности PAM, переключаясь между двумя ошибками — свидетельство того, что Cas9 отвечает за идентификацию PAM во время формирования памяти. В другом эксперименте он изменил часть Cas9, которая связывается с последовательностью PAM, и обнаружил, что микробы затем начали случайным образом получать целевые вирусные последовательности, что сделало их непригодными для использования.
Тем временем Самай изучил взаимосвязь между Cas9 и тремя другими ферментами Cas: Cas1, Cas2 и Csn2. Предполагалось, что эти ферменты, являющиеся компонентами той же системы CRISPR, играют роль в создании памяти без помощи Cas9.
Самай экспрессировал эти ферменты вместе, затем пометил каждый и попытался очистить его.
Но каждый раз выходили и остальные трое. «Это указывает на какое-то взаимодействие между четырьмя четырьмя; скорее всего, они образуют комплекс во время приобретения памяти», — говорит она.
"Из-за своей важности для биотехнологии Cas9’s привлек большой интерес своим действием, направленным на нацеливание и расщепление вирусных геномов.
Наша работа показывает, что Cas9 недооценивается: формирование воспоминаний, которые делают возможным адаптивный иммунитет для бактерий », — говорит Марраффини.