«Никогда не существовало действительно хорошего способа взглянуть на функцию всех генов у любого апикомлексного паразита», — говорит научный сотрудник Уайтхеда Себастьян Луридо. «Мы ввели метод оценки функции всего генома. Эту технологию можно использовать для изучения множества тем, от получения питательных веществ и реакции на иммунное давление до эпистаза и генетических взаимодействий. Это важный шаг вперед в том, что можно исследовать этих паразитов ».По оценкам Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), более 60 миллионов человек в Соединенных Штатах инфицированы T. gondii.
Передача может происходить при попадании в организм ооцитов из инфицированных кошачьих фекалий или при употреблении в пищу недоваренного мяса, содержащего цисты токсоплазмы. После заражения у некоторых здоровых людей в течение месяца или более наблюдаются гриппоподобные симптомы, но заболевание может вызвать судороги и потенциально смертельный энцефалит у людей с ослабленным иммунитетом, включая пациентов, получающих трансплантаты, людей с ВИЧ / СПИДом, больных раком, пожилых и молодых. дети. Если мать заразилась во время беременности, она может передать паразита своему плоду, что может привести к выкидышу, мертворождению, повреждению мозга или глаз или потере слуха у ее ребенка.Хотя токсоплазмоз может быть серьезным заболеванием, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), другой апикомплексан, вызывающий малярию паразит Plasmodium falciparum, унес жизни более 400000 человек в 2015 году.
Поскольку T. gondii и P. falciparum тесно связаны, T. gondii может служить модельным организмом для исследования своего более опасного родственника. Однако исследованиям T. gondii препятствовала неспособность ученых быстро и эффективно подавить гены. РНК-интерференция (РНКи), эффективный инструмент для оценки функции генов у многих организмов, в значительной степени неэффективен в апикомплексах, в то время как случайный мутагенез трудно интерпретировать, поскольку измененный ген трудно идентифицировать.
Генетическое скрещивание также сложно осуществить, потому что половые стадии паразита встречаются только у кошек.Кроме того, изменение генома T. gondii с использованием системы редактирования CRISPR / Cas9 было ограничено токсичностью фермента Cas9.
Чтобы преодолеть это препятствие, ученые в лаборатории Луридо создали «ложную» однонаправленную РНК, которая эффективно снижает гиперактивность Cas9 в геноме. Используя эту «подавленную» систему CRISPR / Cas9, исследователи смогли нарушить работу каждого из 8 158 генов T. gondii и изучить их индивидуальные функции. Этот подход выявил около 200 генов, присутствующих во всех апикомплексах, которые вносят вклад в приспособленность паразитов во время инфицирования клеток человека.Один из этих генов кодирует белок, который команда назвала клаудиноподобным апикомлексановым микронемным белком (CLAMP), который оказывает сильное влияние на вторжение паразита в клетки-хозяева.
Чтобы далее проанализировать роль белка и подтвердить его необходимость в другом апикомлексане, команда работала с лабораторией Жакина Найлса из Массачусетского технологического института, чтобы разрушить белок в P. falciparum. Без функционального CLAMP малярийные паразиты не могли расти в красных кровяных тельцах. Выводы команды описаны в Интернете на этой неделе в журнале Cell.
Хотя полногеномная система CRISPR / Cas9 хорошо работает у T. gondii, эквивалентная стратегия все еще отсутствует для P. falciparum.«С малярией действительно трудно бороться таким же образом», — говорит Диего Хуэ, научный сотрудник лаборатории Луридо и соавтор статьи о Cell. "Поскольку его геном богат аденином (A) и тимином (T), трудно создать разрезы там, где вы хотите. Малярийным паразитам также не хватает негомологичного пути соединения концов для репарации ДНК, требующего репарационной матрицы, когда сокращение с помощью CRISPR / Cas9.
Эти проблемы представляют собой техническое препятствие для аналогичных общегеномных подходов к этому паразиту, что делает Toxoplasma еще более важной моделью для малярии. Мы так много можем изучить ».Сайма Сидик, соавтор исследования и научный сотрудник лаборатории Луридо, соглашается, добавляя: «Теперь мы можем начать изменять среду, в которой находятся паразиты, и посмотреть, как они реагируют. Мы можем изменить среду, добавляя лекарства, добавляя иммунное давление или попытки заражения паразитами разных типов клеток.
Мы можем разрушить весь геном за неделю, тогда как раньше мы могли делать только один ген в месяц. С CRISPR-скринингом возможности безграничны ».