Это новое приложение для системы редактирования генов CRISPR / Cas9 должно позволить ученым более легко определять функции отдельных генов, по словам Фен Чжана, W.M. Кек Профессор по развитию карьеры в области биомедицинской инженерии в отделах мозга и когнитивных наук и биологической инженерии Массачусетского технологического института, а также член Института Броуда и Института исследований мозга Макговерна при Массачусетском технологическом институте.
Этот подход также дает возможность быстрого функционального скрининга всего генома, позволяя ученым идентифицировать гены, участвующие в определенных заболеваниях. В исследовании, опубликованном 10 декабря в онлайн-выпуске журнала Nature, Чжан и его коллеги идентифицировали несколько генов, которые помогают клеткам меланомы стать устойчивыми к лекарству от рака.Сильвана Конерманн, аспирантка лаборатории Чжана, и Марк Бригам, постдок Института Макговерна, являются ведущими авторами статьи.Новая функция для CRISPR
Система CRISPR основана на клеточном механизме, который бактерии используют для защиты от вирусной инфекции. Исследователи ранее использовали эту клеточную систему для создания комплексов редактирования генов, которые включают в себя фермент, расщепляющий ДНК, называемый Cas9, связанный с короткой направляющей цепью РНК, которая запрограммирована на связывание с определенной последовательностью генома, сообщая Cas9, где ее разрезать.
За последние два года ученые разработали Cas9 как инструмент для отключения генов или замены их другой версией. В новом исследовании Чжан и его коллеги сконструировали систему Cas9 для включения генов, а не для их выключения.Ученые пытались сделать это, прежде чем использовать белки, которые индивидуально сконструированы для нацеливания ДНК на определенные участки.
Однако с этими белками сложно работать. «Если вы используете старое поколение инструментов, заставить технологию делать то, что вы действительно хотите, — это самостоятельный проект», — говорит Конерманн. «Это занимает много времени и к тому же довольно дорого».Также были попытки использовать CRISPR для включения генов путем инактивации части фермента Cas9, которая разрезает ДНК, и связывания Cas9 с частями белков, называемыми доменами активации. Эти домены задействуют клеточный аппарат, необходимый для начала считывания копирования РНК из ДНК, процесса, известного как транскрипция.Однако эти усилия не смогли последовательно включить транскрипцию генов.
Чжан и его коллеги, Осаму Нуреки и Хироши Нисимасу из Токийского университета, решили пересмотреть систему CRISPR-Cas9 на основе опубликованного ранее в этом году анализа структуры, формирующейся, когда Cas9 связывается с направляющей РНК и ее целевой ДНК. «Зная его трехмерную форму, мы можем подумать о том, как рационально улучшить систему», — говорит Чжан.В предыдущих попытках ученые пытались прикрепить активационные домены к любому концу белка Cas9, но с ограниченным успехом.
Из своих структурных исследований команда MIT поняла, что две небольшие петли проводника РНК выходят из комплекса Cas9 и могут быть лучшими точками прикрепления, поскольку они позволяют доменам активации иметь большую гибкость в рекрутировании аппарата транскрипции.Используя свою обновленную систему, исследователи активировали около десятка генов, которые оказалось трудно или невозможно включить с помощью активаторов Cas9 предыдущего поколения. Каждый ген показал как минимум двукратное усиление транскрипции, а для многих генов исследователи обнаружили увеличение активации на несколько порядков.Скрининг активации в масштабе генома
Как только исследователи показали, что система эффективна при активации генов, они создали библиотеку из 70 290 направляющих РНК, нацеленных на все более чем 20 000 генов в геноме человека.Они проверили эту библиотеку, чтобы идентифицировать гены, которые придают устойчивость к препарату от меланомы под названием PLX-4720. Этот препарат эффективен. Препараты этого типа хорошо работают у пациентов, клетки меланомы которых имеют мутацию в гене BRAF, но раковые клетки, пережившие лечение, могут перерасти в новые опухоли, что приведет к рецидиву рака.
Чтобы обнаружить гены, которые помогают клеткам стать устойчивыми, исследователи доставили компоненты CRISPR в большую популяцию клеток меланомы, выращенных в лаборатории, при этом каждая клетка получила свою направляющую РНК, нацеленную на другой ген. После обработки клеток PLX-4720 они идентифицировали несколько генов, которые помогли клеткам выжить — некоторые из них, как ранее было известно, участвуют в устойчивости к лекарствам, а также несколько новых мишеней.Подобные исследования могут помочь исследователям открыть новые лекарства от рака, которые предотвращают развитие резистентности опухолей.
«Вы можете начать с препарата, нацеленного на мутировавший BRAF, вместе с комбинированной терапией, нацеленной на гены, позволяющие клетке выжить. Если вы нацелитесь на них обоих одновременно, вы, вероятно, сможете предотвратить развитие в клетках механизмов устойчивости, которые позволят в дальнейшем рост, несмотря на медикаментозное лечение », — говорит Конерманн.Ученые пытались провести подобный крупномасштабный скрининг, доставляя отдельные гены, переносимые вирусами, но это не работает со всеми генами.
Лаборатория Чжана также планирует использовать эту технику для скрининга генов, которые при активации могут корректировать эффекты аутизма или нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Он также планирует сделать необходимые реагенты доступными для академических лабораторий, которые хотят их использовать, через репозиторий Addgene.
Исследование финансировалось Национальным институтом психического здоровья; Национальный институт неврологических расстройств и инсульта; фонды Keck, Searle Scholars, Klingenstein, Vallee и Simons; и Боб Меткалф.