Теперь Майкл Нидервейс, доктор философии, профессор микробиологии Университета Алабамы в Бирмингеме, и его коллеги описали первый известный токсин этой патогенной бактерии. Этот токсин — туберкулезный некротизирующий токсин или TNT — является одним из основателей нового класса ранее нераспознанных токсинов, присутствующих у более чем 600 видов бактерий и грибов, что определяется сходством белковых последовательностей. До открытия Нидервейса эти токсины были идентифицированы только как «Область неизвестной функции 4237».Бактерии с этими недавно обнаруженными токсинами включают Yersinia pestis, патоген, вызвавший бубонную чуму, известную как Черная смерть в средневековой Европе, и Listeria monocytogenes, одну из самых ядовитых и смертоносных инфекций пищевого происхождения, и причина появления Blue Bell Creameries напоминает об этом. год.
Отсутствие идентифицированного токсина у M. tuberculosis контрастировало почти со всеми другими патогенными бактериями, токсины которых способствуют болезни или смерти.M. tuberculosis отличается тем, что выживает внутри макрофагов, иммунных клеток, которые поглощают и уничтожают инфекционные бактерии.
По словам Нидервейса, недавно идентифицированный TNT играет ключевую роль в индукции некротической гибели инфицированного макрофага. Таким образом, TNT позволяет бактериям M. tuberculosis ускользать из макрофага и распространяться в другие клетки-хозяева у человека, инфицированного туберкулезом, тем самым способствуя выживанию M. tuberculosis и распространению болезни.«Битва между M. tuberculosis и иммунной системой человека за контроль над судьбой инфицированных макрофагов имеет решающее значение для определения исхода инфекции», — написал Нидервейс в газете TNT. «Контроль гибели клеток-хозяев имеет первостепенное значение для выживания, ускользания и распространения M. tuberculosis».
Документ «Токсин, вызывающий туберкулез, убивает макрофаги путем гидролиза НАД», был опубликован в Интернете 3 августа в журнале Nature Structural. Молекулярная биология.Как этот токсин ускользал от обнаружения более века?
Во-первых, он производится in vitro только в очень небольших количествах — лаборатория Niederweis смогла обнаружить его только в фильтрате клеточной культуры, который был сконцентрирован в 1000 раз, что эквивалентно концентрации галлона молока примерно до одной трети чайной ложки. Во-вторых, токсин смертелен только тогда, когда он находится внутри цитозоля клетки-хозяина; если токсин находится в кровотоке или добавлен в культуральную среду клеток-хозяев in vitro, он не оказывает никакого воздействия. В-третьих, этот токсин не похож ни на один другой известный токсин.
Нидервейс обнаружил TNT в поисках чего-то совершенно другого. Он искал белки внешней мембраны, которые могут действовать как дверь, позволяющая питательным веществам вне бактерий проходить через чрезвычайно непроницаемый барьер внешней мембраны M. tuberculosis.
Группа Niederweis думала, что они нашли такой белок порина; но у него было необычное свойство — концевая часть белка отрывалась после образования поры во внешней мембране, и эта концевая часть была чрезвычайно токсичной как для простых прокариотических клеток, таких как бактерии, так и для более сложных эукариотических клеток дрожжей, млекопитающие и рыбы. В статье, опубликованной в Proceedings of the National Academy of Sciences в 2014 году, Нидервейс сказал, что это открытие «бросает вызов парадигме, согласно которой M. tuberculosis является одним из немногих бактериальных патогенов, не продуцирующих токсины».Настоящая статья полностью устанавливает эту новую парадигму, идентифицируя механизм TNT-индуцированной некротической гибели клеток на функциональном и структурном уровнях. Подобно оптической иллюзии, где сначала видна ваза, а затем кажется, что два лица смотрят друг на друга, Нидервейс изначально полагал, что он нашел порин на внешней мембране, который пропускает питательные вещества и несет артефакт.
Теперь он видит поровую часть этого белка как бактериальный аутотранспортер (подобный тем, что наблюдается у других бактерий), который имеет миссию экспортировать свой белковый груз TNT за пределы внешней мембраны. После завершения экспорта пора транспортера остается во внешней мембране.Сходство гена TNT с последовательностями ДНК более чем 600 других штаммов бактерий и грибов позволит исследовать, как этот новый класс токсинов может действовать в других патогенах, особенно в микроорганизмах, выживание или распространение которых зависит от индукции некроза.
Вот некоторые подробности о TNT:1) В ходе кропотливых поисков молекулярной функции TNT, Джим Сан, доктор философии, постдок из лаборатории Niederweis, обнаружил, что TNT гидролизует важный кофермент никотинамид адениндинуклеотид (NAD +).
Это объясняет, почему он убивает все типы клеток, в которые клонируется, потому что NAD + необходим для нормального метаболизма клетки. Исследователи смогли клонировать ген TNT, только поместив его рядом с индуцибельным промотором, который жестко подавляет транскрипцию до индуцирования. Фермент TNT гидролизует НАД + внутри клеток и in vitro.
Он блокируется антителами против TNT и специфическими точечными мутациями TNT, которые устраняют всю ферментативную активность.2) Этот некаталитический мутант TNT не способен убивать макрофаги, показывая, что гидролазная активность необходима для индуцированной TNT гибели клеток.
3) Если тротил продуцируется внутри M. tuberculosis, он убивает клетку. Нидервейс и его коллеги обнаружили, что M. tuberculosis, подобно бактериальному патогену Streptococcus pyogenes, вырабатывает антитоксин к своему токсину.
Антитоксин TNT связывается с токсином и блокирует его гидролазную активность, что делает его безвредным внутри бактерий. Исследователи назвали фактор иммунитета к антитоксину TNT (IFT).4) Клонирование генов TNT и IFT в E. coli, где IFT защищает бактерии от гибели, позволило исследователям получить миллиграммы TNT и IFT. Совместными усилиями Джино Чинголани, доктор философии, профессор из Университета Томаса Джефферсона, произвел кристаллы очищенного белкового комплекса и определил его молекулярную структуру с удивительным разрешением 1,1 А всего за несколько недель.
Молекула TNT имеет форму хватательной руки с пальцами на одной стороне и вытянутым большим пальцем — с другой. IFT вписывается в TNT, как мяч в руке.5) Когда патогенный M. tuberculosis растет внутри фагосомы макрофага, TNT быстро получает доступ к цитозолю инфицированного макрофага и гидролизует NAD +, истощая этот важный кофактор. Это инициирует некротическую гибель клеток посредством последующих сигналов, которые еще не охарактеризованы.
Любопытно, что поиск в литературе показал, что полвека назад была описана нехарактеризованная термостабильная НАД + -гликогидролазная активность в экстрактах клеток M. tuberculosis, а также нехарактеризованный термолабильный ингибитор этой гидролазной активности. Некоторые биохимические характеристики TNT и IFT, обнаруженные лабораторией Niederweis, соответствуют характеристикам неохарактеризованных белков, описанных в отчетах 1960-х годов.
Однако отсутствие современного оборудования и антител на сегодняшний день, а также очень низкие уровни TNT, присутствующие в M. tuberculosis, помешали этим исследователям обнаружить токсин.