Эта задача жизни или смерти обеспечивает выживание клетки и организма, которому она принадлежит. Нарушения способности клетки удалять поврежденные митохондрии были связаны с различными состояниями, от рака до нейродегенеративных заболеваний, особенно с болезнью Паркинсона, при которой энергоемкие нейроны очень уязвимы к токсическим эффектам дефектных митохондрий.В выпуске Molecular Cell от 19 апреля ученые Гарвардской медицинской школы сообщают о разработке новой техники для анализа с беспрецедентной количественной точностью того, как клетки инициируют удаление дефектных митохондрий посредством аутофагии клетки, или системы "самопоедания". Методология позволила им впервые изучить этот процесс в нейронах человека, полученных из стволовых клеток.
Сделав «цифровые снимки» белкового ландшафта, когда клетки маркируют поврежденные митохондрии для аутофагии, исследовательская группа создала самую четкую на сегодняшний день картину динамики этого процесса, включая абсолютные измерения реакций модификации белков, их количества и изменений во времени.По словам авторов, полученные результаты создают основу для подробных исследований связи между повреждением митохондрий, гибелью клеток и заболеванием, а также устанавливают технологический подход, который можно использовать для раскрытия механизмов дефектных клеточных путей во многих других контекстах.«Если когда-нибудь появится лекарство, которое нацелено на этот путь с целью лечения болезни Паркинсона или других нейродегенеративных заболеваний, нам понадобится этот уровень детализации, чтобы понять, как работают кандидаты на лекарства», — сказал старший автор исследования Дж.
Уэйд Харпер. , HMS Bert and Natalie Vallee, профессор молекулярной патологии и заведующий кафедрой клеточной биологии.Система молекулярной сигнализации для контроля качества митохондрий включает два фермента: протеинкиназу PINK1, которая химически модифицирует белки с помощью фосфата, и убиквитинлигазу PARKIN, которая маркирует целевые белки молекулой, называемой убиквитином.В нормальных условиях здоровые митохондрии несут на своей внешней поверхности небольшое количество PINK1. Однако при повреждении митохондрии накапливают PINK1, который передает фосфат PARKIN для его активации.
После активации PARKIN передает убиквитин множеству различных белков, создавая «убиквитиновую оболочку» на поверхности митохондрий. Когда достигается определенный порог убиквитина, запускается механизм клеточного «самопоедания», что приводит к деградации митохондрий.Мутации в PINK1 и PARKIN были связаны многочисленными исследованиями с болезнью Паркинсона, которая включает гибель определенных нейронов и накопление неправильно свернутых белков в головном мозге.
Исследователи добились больших успехов в описании пути PINK1-PARKIN, но многие из его важнейших особенностей остались плохо изученными.Пошив пальто
Известно, что убиквитин маркирует свои целевые белки на определенных остатках аминокислоты лизина. Однако это происходит только для небольшого подмножества остатков лизина, и точное определение того, какие лизины модифицируются и почему было сложной задачей для данной области, особенно для более чем дюжины мишеней PARKIN на поверхности митохондрий. Кроме того, количество этих целей было неясным, что могло повлиять на процесс убиквитилирования.
Предыдущая работа лаборатории Harper в сотрудничестве со Стивом Гайджи, профессором клеточной биологии HMS, позволила разработать методы, которые позволяют обнаруживать отдельные остатки лизина в белках, которые связаны с убиквитином.Исследовательская группа расширила этот подход в текущем исследовании.
Под руководством ведущего автора Албана Ордюро, научного сотрудника HMS в области клеточной биологии, они разработали новый метод — мониторинг параллельных реакций мишени PARKIN (Pt-PRM) — для оценки ландшафта убиквитилирования белков, участвующих в контроле качества митохондрий, на беспрецедентном уровне. деталей.Они также создали библиотеку эталонных пептидов, которая позволила им измерить точное количество мишеней PARKIN и отдельные события убиквитилирования на поврежденных митохондриях.По сути, эталонная пептидная библиотека позволила исследователям «подсчитать» события убиквитилирования сайт-специфическим способом на более чем дюжине митохондриальных поверхностных белков одновременно в масс-спектрометре.
В сочетании с зависящими от времени измерениями после повреждения митохондрий, метод создает «цифровой снимок» событий убиквитилирования на поверхности митохондрий, выявляя не только сайт-специфичность модификации, но и предоставляя количественную картину митохондриального ландшафта.Включив эталонные пептиды, которые обнаруживают PINK1-зависимые события фосфорилирования, команда также смогла интегрировать целевое фосфорилирование с убиквитилированием.«Это один из самых подробных анализов пути убиквитина, который когда-либо проводился. Нет другого исследования, которое бы использовало такой уровень сложности для анализа такого процесса», — сказал Харпер.
Цифровой снимокНовый метод позволяет проводить точные, абсолютные измерения событий убиквитилирования белка, в отличие от предыдущих методов, которые не являются количественными и не обеспечивают специфичности сайта убиквитилирования.«Такой подход теперь дает нам полный динамический диапазон», — сказал Харпер. «Мы можем измерить более трех порядков, чтобы лучше понять кинетику, стехиометрию, пространственную организацию, интеграцию с фосфорилированием и многие другие особенности», — сказал Харпер.Благодаря повышенной точности, команда провела первый количественный анализ событий, связанных с естественным убиквитилированием, в нейронах, полученных из генетически модифицированных стволовых клеток человека, системы, более подходящей для изучения болезней человека, чем предыдущие модели.
Это включало анализ дофаминергических нейронов, потеря которых является основной характеристикой болезни Паркинсона, проведенный в сотрудничестве с Ли Рубином, профессором стволовых клеток и регенеративной биологии в Гарварде. До сих пор большинство исследований в этой области проводилось на иммортализованных раковых клетках человека (HeLa), сконструированных для экспрессии PARKIN на неестественно высоких уровнях, чтобы ученые могли измерить их активность.Харпер, Ордюро и его коллеги сравнили две модели клеток в своем анализе, выявив сходства и различия в специфичности и времени событий модификации.
Они также обнаружили специфические остатки лизина на белках, которые были избирательно убиквитилированы в нейронах, но не в клетках HeLa, и наоборот. По словам авторов, биологические последствия этих различий остаются неизвестными и являются объектами дальнейших исследований.Анализ помог пролить новый свет на обсуждаемые в настоящее время вопросы в этой области, например, могут ли цепи убиквитина без разбора маркировать белки в митохондриях или точно нацелены на специфические белки.
Ответ может быть «смотря по обстоятельствам». В целом убиквитилирование, по-видимому, зависит от количества белка, но исследователи также обнаружили доказательства избирательности, особенно в определенных структурных элементах целевых белков.Надежность экспериментальной системы также позволила авторам изучить несколько механистических аспектов пути, включая, например, определение роли фосфорилирования PARKIN с помощью PINK1 в нейронах, происходящих из стволовых клеток.
«Мы хотим знать, как работают эти механизмы, потому что мы хотим иметь возможность нацелить их на открытие лекарств или найти способы обойти болезненные мутации у пациентов», — сказал Ордюро. «Теперь мы можем проанализировать этот критический процесс в нейронных клетках очень подробно, и сделать это в масштабе одного эксперимента. При использовании предыдущих методов вам приходилось проводить десятки экспериментов, чтобы получить аналогичные или менее точные результаты».
Эффективность их нового метода теперь позволяет улучшить исследования пути PINK1-PARKIN и его роли в таких заболеваниях, как болезнь Паркинсона, как показано в этой работе для низкомолекулярных активаторов PINK1. По словам авторов, этот подход также может быть адаптирован для раскрытия механизмов дефектных путей в других системах и заболеваниях.
«Убиквитилирование — это основополагающий механизм, который клетки используют для удаления поврежденных или ненужных компонентов для поддержания собственного здоровья и целостности», — сказал Харпер. «Это важно не только для митохондрий, но и для удаления бактерий, белковых агрегатов и других органелл. Эта технология может быть использована, чтобы пролить свет на биохимию многих различных систем».