Яркие видеоролики, созданные с помощью новой технологии, демонстрируют движение и взаимодействие белков по мере того, как клетки реконструируют свои структурные опоры или реорганизуют свои мембраны для поглощения молекул извне клетки. Руководитель группы Janelia Эрик Бетциг, научный сотрудник Донг Ли и их коллеги добавили две новые технологии — обе вариации на SIM-карту — в набор инструментов, доступных для получения изображений сверхвысокого разрешения.
Оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения позволяет получать изображения, пространственное разрешение которых превышает теоретический предел, налагаемый длиной волны света, обеспечивая необычайную визуальную детализацию структур внутри клеток. Но до сих пор методы сверхвысокого разрешения были непрактичными для использования при визуализации живых клеток.
«Эти методы устанавливают новый стандарт того, как далеко вы можете продвинуть скорость и неинвазивность визуализации сверхвысокого разрешения», — говорит Бетциг о методах, описанных его командой в выпуске журнала Science от 28 августа 2015 года. «Это по-настоящему обеспечит сверхвысокое разрешение изображений живых клеток».В традиционных SIM-картах образец под линзой наблюдается, когда он освещается узором света (больше похожим на штрих-код, чем на свет лампы).
Применяется несколько различных световых узоров, и получающиеся в результате муаровые узоры каждый раз снимаются цифровой камерой под разными углами. Затем компьютерное программное обеспечение извлекает информацию из муаровых изображений и преобразует ее в трехмерную реконструкцию с высоким разрешением. Окончательная реконструкция имеет вдвое большее пространственное разрешение, чем можно получить с помощью традиционной световой микроскопии.Бетциг был одним из трех ученых, удостоенных Нобелевской премии по химии 2014 года за разработку флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением.
Он говорит, что SIM не привлекает столько внимания, как другие методы сверхвысокого разрешения, в основном потому, что эти другие методы предлагают более значительный выигрыш в пространственном разрешении. Но он отмечает, что SIM всегда предлагал два преимущества перед альтернативными методами сверхвысокого разрешения, включая фотоактивированную микроскопию локализации (PALM), которую он разработал в 2006 году вместе с коллегой Джанелии Харальдом Хессом.И PALM, и микроскопия стимулированного истощения излучения (STED), другой метод сверхвысокого разрешения, отмеченный Нобелевской премией 2014 года, освещают образцы таким количеством света, что флуоресцентно меченые белки блекнут, а образец быстро повреждается, что делает невозможным длительное получение изображений. SIM, однако, другая. «Я влюбился в SIM-карту из-за ее скорости и того факта, что она требует гораздо меньше света, чем другие методы», — говорит Бетциг.
Бетциг начал работать с SIM вскоре после смерти в 2011 году одного из ее пионеров, Матса Густафссона, который был руководителем группы в Janelia. Бетциг уже был убежден, что SIM обладает потенциалом для глубокого понимания внутренней работы клеток, и подозревал, что улучшение пространственного разрешения этого метода будет иметь большое значение для увеличения его использования биологами.
Густафссон и аспирант Хеспер Рего достигли SIM-карты с более высоким разрешением с вариацией, называемой нелинейной SIM-картой с насыщенным истощением, но этот метод обменивает улучшение пространственного разрешения на более суровые условия и потерю скорости. Бетциг нашел способ обойти этот компромисс.Насыщенное истощение увеличивает разрешение изображений SIM за счет использования флуоресцентных белковых меток, которые можно включать и выключать с помощью света. Для создания изображения все флуоресцентные метки в белке включаются, а затем используется волна света, чтобы отключить большинство из них.
После воздействия дезактивирующего света только молекулы в самых темных областях световой волны продолжают флуоресцировать. Они предоставляют информацию с более высокой частотой и повышают резкость результирующего изображения.
Изображение фиксируется, и цикл повторяется 25 или более раз для генерации данных для окончательного изображения. По словам Бетцига, принцип очень похож на способ достижения сверхразрешения в STED или связанном с ним методе, называемом RESOLFT.
По его словам, этот метод не подходит для визуализации в реальном времени, потому что включение и выключение фотоактивируемых молекул занимает слишком много времени. Более того, повторяющееся воздействие света повреждает клетки и их флуоресцентные метки. «Проблема с этим подходом заключается в том, что вы сначала включаете все молекулы, а затем сразу выключаете почти все молекулы. Отключенные вами молекулы ничего не вносят в изображение, но вы просто поджарили их дважды. . Вы напрягаете молекулы, и на это уходит много времени, которого у вас нет, потому что клетка движется ».
Решение было простым, говорит Бетциг: «Не включайте все молекулы. В этом нет необходимости».
Вместо этого новый метод, называемый нелинейной SIM-картой с фотоактивацией с рисунком, начинается с включения только части флуоресцентных меток в образце с рисунком света. «Структурирование этого уже дает вам некоторую информацию с высоким разрешением», — объясняет он. Новый образец света используется для дезактивации молекул, и дополнительная информация считывается из их дезактивации.
Комбинированный эффект этих рисунков приводит к получению конечных изображений с разрешением 62 нанометра — лучше, чем у стандартной SIM-карты, и в три раза лучше по сравнению с ограничениями, налагаемыми длиной волны света.«Мы можем это сделать, и мы можем сделать это быстро», — говорит он. По его словам, это важно, потому что для визуализации динамических процессов увеличение пространственного разрешения бессмысленно без соответствующего увеличения скорости. «Если что-то в ячейке движется со скоростью один микрон в секунду, а у меня разрешение один микрон, я могу сделать это изображение за секунду.
Но если у меня разрешение 1/10 микрона, я должен снимать данные с точностью до одной десятой доли секунды. на секунду, а то размазывается », — поясняет он.Нелинейная SIM-карта с структурированной фотоактивацией захватывает 25 изображений, которые проходят окончательную реконструкцию примерно за одну треть секунды. Поскольку он делает это эффективно, используя свет низкой интенсивности и собирая информацию о каждом фотоне, испускаемом флуоресцентными метками образца, метки сохраняются, чтобы микроскоп мог снимать дольше, позволяя ученым наблюдать, как разворачивается больше действий.
Команда использовала структурированную нелинейную SIM-карту с фотоактивацией для создания видеороликов, показывающих, как структурные белки разрушаются и собираются вместе, когда клетки движутся и меняют форму, а также динамику крошечных ямок на поверхности клеток, называемых кавеолами.Команда Бетцига также сообщает в статье Science, что они могут повысить пространственное разрешение SIM до 84 нанометров, получая изображения с помощью имеющегося в продаже объектива микроскопа со сверхвысокой числовой апертурой. Апертура ограничивает воздействие света на очень небольшую часть образца, ограничивая повреждение клеток и флуоресцентных молекул, и этот метод можно использовать для одновременного отображения нескольких цветов, поэтому ученые могут одновременно отслеживать несколько разных белков.
Используя подход с высокой числовой апертурой, команда Бетцига смогла наблюдать движения и взаимодействия нескольких структурных белков во время формирования фокальных адгезий, физических связей между внутренним и внешним пространством клетки. Они также проследили рост и интернализацию ямок, покрытых клатрином, структур, которые облегчают поступление молекул извне клетки. Их количественный анализ ответил на несколько вопросов о распределении ямок и взаимосвязи между размером ямок и продолжительностью жизни, которые не могли быть решены с помощью предыдущих методов визуализации.Наконец, комбинируя подход с высокой числовой апертурой с структурированной фотоактивируемой нелинейной SIM-картой, Бетциг и его коллеги могли отслеживать два белка одновременно с более высоким разрешением, чем подход с высокой числовой апертурой, предлагаемый сам по себе.
Команда Betzig продолжает развивать свои технологии SIM и говорит, что возможны дальнейшие улучшения. Они также хотят работать с биологами, чтобы продолжить изучение потенциальных приложений и улучшить удобство использования своих методов.На данный момент ученые, которые хотят поэкспериментировать с новыми методами SIM, могут организовать это в Advanced Imaging Center Janelia, который предоставляет бесплатный доступ к передовым технологиям микроскопии.
В конце концов, говорит Бетциг, сделать технологии SIM-карт доступными и доступными для других лабораторий должно быть довольно просто. «Большая часть волшебства заключается в программном обеспечении, а не в оборудовании», — говорит он.