Новый метод, получивший название MAPseq (Мультиплексный анализ проекций путем секвенирования), позволяет в одном эксперименте отслеживать дальнодействующие проекции большого количества отдельных нейронов из определенной области или областей в то место, куда они ведут в мозге. в экспериментах, которые во много раз дешевле, трудоемки и требуют много времени, чем позволяют современные картографические технологии.
Хотя в настоящее время осуществляется ряд важных проектов по картированию мозга, все эти усилия по получению «коннектомов» или схем разводки опираются на микроскопы и соответствующее оптическое оборудование для отслеживания бесчисленных нитевидных выступов, которые связывают нейроны с другими нейронами. близко и далеко. Впервые в истории MAPseq «превращает задачу картирования мозга в одно из секвенирования РНК», — говорит его изобретатель Энтони Задор, М.D., Ph.D., профессор лаборатории Колд-Спринг-Харбор.
«Последовательности РНК, или« штрих-коды », которые мы доставляем отдельным нейронам, безошибочно уникальны, — объясняет Задор, — и это позволяет нам определить, адаптированы ли отдельные нейроны, в отличие от целых регионов, для конкретных целей.»
MAPseq отличается от широко используемых в настоящее время методов так называемого «массового отслеживания», в которых маркер — обычно флуоресцентный белок — экспрессируется нейронами и переносится вдоль их аксонов.
Такие маркеры хороши для определения всех областей, куда проецируются нейроны в исходной области, но они не могут сказать ученым, что любые два нейрона в исходной области проецируются в одну и ту же область, в разные области или в некоторые из тех же областей, и некоторые другие. Эта неспособность определить аксоны нейрона, клетка за клеткой в данном регионе, и побудила Задора разработать новую технику.
Один из способов объяснить преимущество MAPseq над методами массового отслеживания — это представить, что вы находитесь в международном аэропорту с намерением попасть, скажем, в Германию. «Если вы подойдете к международному терминалу, вы увидите длинную очередь билетных касс», — объясняет Задор. «Если вы хотите поехать в Германию, недостаточно сесть на рейс какой-либо авиакомпании в международном терминале.
Если вы стоите в очереди у стойки регистрации Air Chile, вы, вероятно, не сможете купить билет в Германию.»
«Те многие авиакомпании, чьи стойки расположены рядом, обслуживают множество направлений, некоторые из которых пересекаются, а некоторые уникальны. Вы можете распечатать карту, на которой показаны все зарубежные страны, которые все авиакомпании обслуживают из вашего аэропорта, но это ничего не скажет вам об отдельных авиакомпаниях и о том, куда они направляются. В этом разница между текущими методами маркировки и MAPseq. «Отдельные авиалинии» в моем примере — это соседние нейроны в части мозга, «маршруты» которых мы хотим отследить.»
Задор и его команда, в том числе Юстус Кебшулл, аспирант в своей лаборатории, который является первым автором статьи о Neuron, представляющей новый метод, потратили несколько лет на разработку технологии, которая позволяет им назначать уникальные идентификаторы, подобные штрих-коду, для большого количества отдельные нейроны с помощью одной инъекции в любую интересующую область мозга. Каждая инъекция состоит из деактивированного вируса, который был сконструирован так, чтобы содержать массивные пулы индивидуально уникальных молекул РНК, каждая из которых последовательность, состоящая из 30 «букв» или нуклеотидов, воспринимается отдельными нейронами. Тридцать букв дают во много-много раз больше последовательностей штрих-кода (1018), чем нейронов в мозгу мыши или человека, поэтому этот метод особенно хорошо подходит для решения огромной проблемы сложности, которую представляет картирование мозга.
Инъекция в «исходную» область мозга содержит вирусную библиотеку, кодирующую разнообразную коллекцию последовательностей штрих-кода, которые связаны с сконструированным белком, предназначенным для переноса штрих-кода по аксональным путям. РНК штрих-кода экспрессируется на высоком уровне и транспортируется в терминалы аксонов в исходной области, где производится инъекция. В каждом нейроне он перемещается в точку, где аксон образует синапс с проекцией от другого нейрона.
Тесты показывают, что технология работает — штрих-коды надежно и равномерно перемещаются по мозгу, вдоль «магистральных линий», которые являются аксонами, и до «точек ветвления», где образуются синапсы.
Примерно через два дня после одной или нескольких инъекций в интересующую область мозг рассекают, собирают и секвенируют РНК. Штрих-коды РНК в «исходной» области теперь совпадают с теми же штрих-кодами, собранными в отдаленных частях мозга.
«Секвенирование РНК — это высокоэффективный автоматизированный процесс, который делает MAPseq таким потенциально радикальным инструментом», — говорит Кебшулл. «Помимо скорости и экономичности секвенирования РНК, у него есть большое преимущество, позволяющее исследователям различать отдельные нейроны в одной и той же области, которые проецируются в разные части мозга.»
Чтобы продемонстрировать возможности MAPseq, команда Задора ввела часть мозга мыши, названную locus coeruleus (LC), расположенную в стволе мозга. Это единственный источник норадреналина, гормона, который сигнализирует об удивлении.
Команда Задора использовала MAPseq, чтобы ответить на старый вопрос: транслируется ли сигнал «неожиданности» повсюду в коре или только в определенные места, где, возможно, он наиболее необходим или актуален?
В их демонстрационном эксперименте была секвенирована только РНК, которая оказалась в коре или обонятельной луковице, а также в исходной области в ЖК, где изначально были введены штрих-коды. Команда разделила кору на 22 среза, каждый толщиной около 300 микрон, и рассекла срезы. Результаты порадовали команду.
«Мы обнаружили, что нейроны в LC имеют множество идиосинкразических паттернов проекции», — говорит Задор. «Некоторые нейроны проецируются почти исключительно на одну предпочтительную цель в коре или обонятельной луковице. Другие нейроны проецируются шире, хотя и слабо.»
Эти результаты, добавляет он, «согласуются с предыдущими, казалось бы, противоречивыми результатами о прогнозах LC.»Сигнал неожиданности может достигать большинства частей мозга, но есть очень определенные части мозга, где сигнал особенно сфокусирован.
Команда показала, что результаты могут быть получены в экспериментах на основе одной инъекции в ЖХ, а также двух инъекций в противоположные стороны. Уже ведутся эксперименты, в которых вся кора головного мозга «облицовывается» инъекциями. Есть надежда, что это даст первый коннектом всей коры при разрешении одного нейрона.
«После того, как мы автоматизируем процесс использования множества инъекций, мы думаем, что такой эксперимент может быть проведен одним человеком всего за неделю или две, и это будет стоить всего несколько тысяч долларов», — говорит Задор. «Мы очень заинтересованы в том, чтобы иметь возможность проводить такого рода исследования на одном животном, что устранит прошлую проблему введения нескольких животных для отслеживания нескольких нейронов, метод, который требует от одного человека составить единую карту, основанную на множестве мозгов, каждый из которых несколько отличается.»
Следующая цель Задора с MAPseq — составить карту мозга животных, моделирующих различные нервно-психические и психические заболевания, чтобы увидеть, как мутации генов, тесно связанные с причинно-следственной связью, изменяют структуру мозговых цепей и, таким образом, предположительно, функцию мозга.
Меня тут стильная мода от https://modof.club заинтересовала, мне кажется такая информация порадует и заинтересует очень многих. По этому, если вам это интересно, то стоит обязательно посмотреть.