«Просто за счет сокращения длины нацеливающей области гРНК мы увидели снижение частоты нежелательных мутаций на всех ранее известных нецелевых сайтах, которые мы исследовали», — говорит Дж. Кейт Джунг, доктор медицинских наук, заместитель руководителя отдела исследований в Отделение патологии МГЗ и старший автор отчета. «Некоторые сайты показали снижение частоты мутаций в 5000 или более раз по сравнению с полноразмерными гРНК, и, что важно, эти усеченные гРНК, которые мы называем Tru-гРНК, столь же эффективны, как и полноразмерные гРНК, в достижении намеченной цели. Сегменты ДНК ".CRISPR-Cas RGN сочетают в себе фермент, расщепляющий ген, называемый Cas9, с коротким сегментом РНК и используются для индукции разрывов в комплементарном сегменте ДНК с целью внесения генетических изменений.
В прошлом году группа Юнга сообщила, что в человеческих клетках CRISPR-Cas RGN могут также вызывать мутации в последовательностях ДНК с отличиями до пяти нуклеотидов от мишени, что может серьезно ограничить клиническую ценность белков. Команда продолжила эти открытия, исследуя гипотезу, которая может показаться нелогичной, что сокращение сегмента gRNA может уменьшить нецелевые мутации.«Некоторые из наших прошлогодних экспериментов показали, что можно не согласовывать несколько нуклеотидов на одном конце области комплементарности гРНК, не влияя на целевую активность», — объясняет Джунг. «Это заставило нас задуматься, может ли удаление этих нуклеотидов сделать систему более чувствительной к несовпадениям в оставшейся последовательности».
Основываясь на естественной системе, которую виды бактерий используют против других патогенов, CRISPR-Cas RGN, наиболее широко используемые исследователями, включают 20-нуклеотидную нацеленную область внутри gRNA. Чтобы проверить свою теорию, команда MGH сконструировала RGN с прогрессивно более короткими gRNA и обнаружила, что, в то время как gRNA с целевыми сегментами из 17 или 18 нуклеотидов были такими же или более эффективными, чем полноразмерные gRNA, в достижении своих целей, те, которые имели 15 или 16 нуклеотидов.
Нуклеотидные нацеленные сегменты имели пониженную целевую активность или отсутствовали. Последующие эксперименты показали, что укороченные по 17 нуклеотидов RGN эффективно индуцируют желаемые мутации в клетках человека со значительным снижением или не обнаруживаемыми эффектами вне мишени, даже в сайтах с одним или двумя несовпадениями.
«Хотя мы не до конца понимаем механизм, с помощью которого tru-gRNAs снижают нецелевые эффекты, наша гипотеза состоит в том, что исходная система может иметь больше энергии, чем ей нужно, что позволяет ей расщеплять даже несовершенные сайты», — говорит Джунг, который доцент кафедры патологии Гарвардской медицинской школы. «Укорачивая гРНК, мы можем снизить энергию до уровня, достаточного для активности на мишени, что сделает нуклеазу менее способной расщеплять сайты, не являющиеся мишенями. Но необходима дополнительная работа, чтобы точно определить, почему Tru-gRNA уменьшили количество нецелевых участков. целевые эффекты ".