Команда создала высокопроизводительную платформу редактирования клеток с использованием варианта технологии CRISPR / Cas9, которая позволила им проверить, насколько хорошо различные генетические изменения защищают иммунные клетки от ВИЧ. По словам исследователей, новая система позволяет исследователям быстро модифицировать генетический код недавно пожертвованных иммунных клеток человека и, как мы надеемся, ускорит поиски окончательного излечения ВИЧ-положительных пациентов.
«Это способность, которую исследователи в области ВИЧ давно хотели получить», — сказал постдокторант Джадд Ф. Халтквист, доктор философии, один из соавторов новой статьи. "Я надеюсь, что это решит задачу, которая год назад казалась непреодолимой, и сделает ее тем, что может сделать каждый."
Исследование, опубликованное в сети 25 октября 2016 года в журнале Cell Reports, было проведено лабораториями соавторов Невана Дж. Кроган, доктор философии, профессор клеточной и молекулярной фармакологии в UCSF, директор Института количественных биологических наук (QBI) в фармацевтической школе UCSF и старший научный сотрудник Института Гладстона, и Александр Марсон, доктор медицины, доктор философии, доцент кафедры микробиология и иммунология в Медицинской школе UCSF.
Исследование возглавили Халтквист, которая находится в лаборатории Крогана, и Кэтрин Шуман, доктор философии, научный сотрудник лаборатории Марсона.
Редактирование генов дает возможность вылечить ВИЧ
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с 1980-х годов в области лечения и контроля ВИЧ с помощью антиретровирусных препаратов, лекарства от вируса до сих пор нет, и ежегодно миллионы людей заражаются. Как только вирус проникает в иммунную систему пациента, он может бесконечно скрываться внутри собственной ДНК клеток, что невозможно обнаружить или уничтожить с помощью современных технологий.
В результате пациенты должны продолжать принимать антиретровирусные препараты до конца своей жизни.
Однако не все восприимчивы к вирусу. Ученые черпали вдохновение у группы людей, чьи иммунные клетки кажутся естественно устойчивыми к ВИЧ-инфекции, и надеются однажды отредактировать иммунную систему пациентов с ВИЧ, чтобы имитировать биологию этих устойчивых к ВИЧ людей.
«Было приложено много усилий, чтобы секвенировать геномы устойчивых людей, чтобы обнаружить мутации, которые делают их невосприимчивыми к вирусу», — сказал Халтквист. "Но есть много разных генов, которые могут быть задействованы: одни контролируют способность вируса проникать в иммунные клетки, другие контролируют, как вирус заставляет клетки экспрессировать свои гены.
До сих пор не было возможности проверить, какая из этих мутаций действительно придает устойчивость первичным Т-клеткам человека."
Платформа на основе CRISPR призвана ускорить поиск лекарств
Несмотря на то, что Т-клетки являются ведущими борцами иммунной системы, они хрупкие — они способны выжить вне тела только пару недель. Они также устойчивы к вирусам, которые исследователи используют в других типах клеток для доставки инструкций ДНК о том, как построить механизм, необходимый для редактирования генов CRISPR / Cas9. В прошлом году Марсон и Шуман впервые успешно использовали CRISPR для выполнения точных замен последовательностей ДНК в первичных Т-клетках человека, предварительно изготовив оборудование CRISPR в пробирках, а затем добавив его к недавно пожертвованным иммунным клеткам.
"Это невероятно быстро", — сказал Шуман. "Требуемое редактирование происходит быстро, а затем ячейка разрушает механизм CRISPR, поэтому он не может продолжать вносить изменения.
Это действительно важно: иначе это все равно, что сделать операцию и оставить в скальпеле."
В новой статье Шуман и Халтквист улучшили методику, разработав автоматизированную систему для высокопроизводительного параллельного редактирования Т-клеток. Новый подход позволяет исследователям мутировать различные гены-кандидаты в сотнях тысяч Т-клеток от здоровых добровольцев, подвергать эти мутантные клетки воздействию вируса ВИЧ, а затем проверять клетки, чтобы найти, какие мутации смогли предотвратить инфекцию.
Ключевой особенностью этой системы является ее скорость, поскольку пожертвованные Т-клетки могут выжить вне тела только в течение двух-трех недель. «Если мы хотим начать редактировать Т-клетки и возвращать их людям в качестве терапии, — сказал Кроган, — я думаю, что это будет золотой стандарт того, как сделать это быстро, безопасно и эффективно."
Исследователи использовали новую технику для мутации генов CXCR4 и CCR5, которые кодируют рецепторные молекулы, которые разные штаммы вируса ВИЧ используют для проникновения и заражения иммунных клеток и которые были нацелены на предыдущие испытания клеточной терапии.
Инактивация любого из этих генов успешно блокировала ВИЧ-инфекцию человеческих Т-клеток соответствующим штаммом ВИЧ.
Дополнительные эксперименты показали возможность создания двухуровневой системы безопасности для Т-клеток путем одновременного блокирования гена, необходимого вирусу ВИЧ для проникновения в клетки, и гена, необходимого вирусу для выживания и размножения внутри клетки, что приводит к вдвойне надежной устойчивости.
Чтобы продемонстрировать эффективность и мощь новой высокопроизводительной технологии, исследователи также разработали 146 различных редакций на основе CRISPR, каждая из которых предназначена для деактивации одного из 45 генов, связанных со способностью ВИЧ интегрироваться в клетки-хозяева.
Они идентифицировали несколько генов, отсутствие которых обеспечивало устойчивость к ВИЧ, некоторые из которых были предсказаны предыдущими исследованиями, а другие никогда не были напрямую связаны с ВИЧ-инфекцией раньше.
«Вершина айсберга» для исследования инфекционных заболеваний
Исследователи планируют использовать новую платформу для выявления дополнительных слабых мест в жизненном цикле вируса ВИЧ, которые могут быть использованы либо с помощью клеточной терапии, либо с помощью таргетных лекарств. Они также хотят иметь возможность вставлять более тонкие мутации, такие как те, о которых сообщалось у устойчивых к ВИЧ людей, которые могут изменить функцию клеток ровно настолько, чтобы вызвать устойчивость, но без полной деактивации гена и нарушения функции клеток.
Однако их большая надежда заключается в том, что система будет иметь гораздо более широкое применение, чем просто ВИЧ, и в конечном итоге будет использоваться в лабораториях по всему миру для изучения вируса по их выбору.
«Этот инструментарий был огромным недостающим звеном в исследованиях инфекционных заболеваний», — сказал Марсон. "Теперь у нас есть возможность вносить изменения в иммунные клетки человека и сразу же видеть результаты. Потенциал огромен — это лишь верхушка айсберга."