В исследовании, опубликованном в Cell, Фен Чжан и его коллеги из Института Броада Массачусетского технологического института и Гарварда и Института Макговерна по исследованию мозга при Массачусетском технологическом институте, с соавторами Юджином Куниным из Национального института здоровья, Авивом Регевым из Института Броуда и Департамент биологии Массачусетского технологического института и Джон ван дер Ост из Университета Вагенингена описывают неожиданные биологические особенности этой новой системы и демонстрируют, что ее можно спроектировать для редактирования геномов человеческих клеток.«Это имеет огромный потенциал для развития генной инженерии», — сказал Эрик Ландер, директор Института Броуда и один из главных руководителей проекта генома человека. «В документе не только раскрывается функция ранее не охарактеризованной системы CRISPR, но также показано, что Cpf1 может быть использован для редактирования генома человека и обладает замечательными и мощными функциями. Система Cpf1 представляет собой новое поколение технологии редактирования генома».
Последовательности CRISPR были впервые описаны в 1987 году, а их естественная биологическая функция была впервые описана в 2010 и 2011 годах. О применении системы CRISPR-Cas9 для редактирования генома млекопитающих впервые сообщили в 2013 году Чжан и отдельно Джордж Черч из Гарварда.В новом исследовании Чжан и его сотрудники просмотрели сотни систем CRISPR у различных типов бактерий в поисках ферментов с полезными свойствами, которые можно было бы разработать для использования в клетках человека.
Двумя многообещающими кандидатами были ферменты Cpf1 из видов бактерий Acidaminococcus и Lachnospiraceae, которые затем показали, что Чжан и его коллеги могут воздействовать на геномные локусы в клетках человека.«Мы были взволнованы, обнаружив совершенно разные ферменты CRISPR, которые можно использовать для продвижения исследований и улучшения здоровья человека», — сказал Чжан.Недавно описанная система Cpf1 отличается от ранее описанной Cas9 по нескольким важным параметрам, что имеет большое значение для исследований и терапии, а также для бизнеса и интеллектуальной собственности:
Во-первых: в своей естественной форме ДНК-режущий фермент Cas9 образует комплекс с двумя небольшими РНК, обе из которых необходимы для режущей активности. Система Cpf1 проще в том, что для нее требуется только одна РНК. Фермент Cpf1 также меньше стандартного SpCas9, что облегчает его доставку в клетки и ткани.
Во-вторых, и это, возможно, наиболее важно: Cpf1 разрезает ДНК иначе, чем Cas9. Когда комплекс Cas9 разрезает ДНК, он разрезает обе нити в одном и том же месте, оставляя «тупые концы», которые часто претерпевают мутации при повторном соединении. В комплексе Cpf1 разрезы в двух нитях смещены, оставляя короткие выступы на открытых концах.
Ожидается, что это поможет с точной вставкой, что позволит исследователям более эффективно и точно интегрировать фрагмент ДНК.В-третьих: Cpf1 разрезает далеко от сайта распознавания, что означает, что даже если целевой ген становится мутированным в сайте разреза, он, вероятно, все еще может быть повторно разрезан, что дает множество возможностей для правильного редактирования.В-четвертых: система Cpf1 обеспечивает новую гибкость в выборе целевых сайтов.
Подобно Cas9, комплекс Cpf1 должен сначала присоединиться к короткой последовательности, известной как PAM, и должны быть выбраны мишени, которые соседствуют с встречающимися в природе последовательностями PAM. Комплекс Cpf1 распознает последовательности PAM, сильно отличающиеся от таковых Cas9. Это может быть преимуществом при нацеливании на некоторые геномы, например, у малярийных паразитов, а также у людей.«Неожиданные свойства Cpf1 и более точное редактирование открывают двери для всех видов приложений, в том числе в исследованиях рака», — сказал Леви Гарравей, член Института Броуда и первый директор Объединенного центра точной медицины при раке. онкологический институт Дана-Фарбер, больница Бригама и женщин и Институт Броуда.
Гарравей не принимал участия в исследовании.Чжан, Институт Броада и Массачусетский технологический институт планируют широко распространить систему Cpf1. Как и в случае с более ранними инструментами Cas9, эти группы сделают эту технологию бесплатно доступной для академических исследований через страницу лаборатории Zhang на веб-сайте Addgene, посвященном обмену плазмидами, с помощью которого лаборатория Zhang уже более 23000 раз поделилась реактивами Cas9 с исследователями по всему миру, чтобы ускорить исследовать.
Лаборатория Zhang также предлагает бесплатные онлайн-инструменты и ресурсы для исследователей на своем веб-сайте http://www.genome-engineering.org.Broad Institute и MIT планируют предлагать неисключительные лицензии, чтобы позволить поставщикам коммерческих инструментов и услуг добавлять этот фермент в свой конвейер и услуги CRISPR, дополнительно обеспечивая доступность этого нового фермента для расширения возможностей исследований.
Эти группы планируют предлагать лицензии, которые наилучшим образом поддерживают быстрое и безопасное развитие для соответствующих и важных терапевтических применений. «Мы стремимся сделать технологию CRISPR-Cpf1 широко доступной, — сказал Чжан.«Наша цель — разработать инструменты, которые могут ускорить исследования и, в конечном итоге, привести к новым терапевтическим применениям.
Мы видим, что впереди будет гораздо больше, даже помимо Cpf1 и Cas9, с другими ферментами, которые могут быть перепрофилированы для дальнейшего прогресса в редактировании генома».