Системы CRISPR-Cas защищают бактерии от захватчиков, например вирусов. Они делают это, создавая небольшие цепочки РНК, которые соответствуют последовательностям ДНК, специфичным для данного захватчика. Когда эти CRISPR-РНК находят совпадение, они высвобождают белки, которые расщепляют ДНК захватчика, предотвращая его репликацию. Однако первый шаг в этом процессе — это не сравнение РНК с целевой ДНК.
Первый шаг включает распознавание и привязку PAM.ПАМ — это короткие генетические последовательности, прилегающие к целевой ДНК у вирусов или других захватчиков.
Когда белок в системе CRISPR-Cas идентифицирует PAM, эта идентификация указывает белку связываться с этой ДНК и начать сравнение соседней последовательности ДНК с РНК CRISPR. Если ДНК и РНК совпадают, то белок расщепляет целевую ДНК.
«Чтобы исследователи могли использовать систему CRISPR-Cas для редактирования генов, регуляции генов или других методов, вам сначала необходимо идентифицировать соответствующие последовательности PAM, которые запускают эту конкретную комбинацию CRISPR-белок», — говорит Чейз Бейзель, доцент кафедры химическая и биомолекулярная инженерия в Государственном университете Северной Каролины и старший автор статьи с описанием работы.«Например, инструмент CRISPR-Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes, имеет другой PAM, чем инструмент CRISPR-Cas9, полученный из Staphylococcus aureus», — говорит Бейзель. «Существуют тысячи потенциальных инструментов CRISPR; чтобы использовать их, нам нужен эффективный способ идентификации их PAM. И мы думаем, что разработали инструменты для этого».Идентификация PAM является сложной задачей, поскольку трудно предсказать, какие генетические последовательности функционируют как PAM для данной системы CRISPR-Cas.
И генетические последовательности, которые функционируют как PAM, широко различаются даже между тесно связанными системами CRISPR-Cas. Например, PAM, который запускает белок Cas9 из S. pyogenes, состоит только из трех нуклеотидов, но PAM, который запускает белок Cas9 из S. aureus, содержит шесть нуклеотидов, ни один из которых не перекрывается с нуклеотидами из S. pyogenes.«Чтобы решить эту проблему, мы разработали инструмент под названием PAM-SCANR», — говорит Райан Линей, аспирант лаборатории Бейзеля и ведущий автор статьи. «PAM-SCANR позволяет нам идентифицировать последовательности PAM для любой данной комбинации CRISPR-белок».Вот как работает PAM-SCANR.
Во-первых, исследователи начинают с системы CRISPR-Cas, для которой они хотят найти PAM. Соответствующая пара CRISPR-белок затем используется в качестве реактивного агента в высокопроизводительном скрининге, при котором пара CRISPR-белок одновременно подвергается воздействию множества различных генных последовательностей. Последовательности генов являются частью генетической конструкции, созданной для того, чтобы загораться — они буквально флуоресцируют — когда с ними связывается пара CRISPR-белок.
А это может произойти только при наличии исправного PAM.«Уникальность этого инструмента заключается в том, что его можно использовать для проверки и идентификации PAM в широком спектре систем CRISPR-Cas», — говорит Линей.
Исследователи протестировали PAM-SCANR в пяти системах CRISPR-Cas для трех из четырех типов CRISPR, которые, как известно, полагаются на работу PAM. Различные типы CRISPR используют разные белки и полагаются на разные механизмы действия.
Исследователи также разработали инструмент, называемый колесом PAM, который помогает исследователям визуализировать выходные данные экранов PAM-SCANR. Это также позволяет исследователям увидеть, насколько одни PAM лучше других.
Это важно, потому что при тестировании PAM-SCANR исследователи обнаружили, что для данной системы CRISPR-Cas может быть несколько PAM — что было неожиданностью — и что некоторые PAM вызывают гораздо более сильную реакцию, чем другие.«Когда мы впервые обнаружили PAM почти десять лет назад, мы изначально думали, что работает только один PAM», — говорит Родольф Баррангу, доцент Департамента пищевых продуктов, биопереработки и питания штата Северная Каролина и старший автор рукописи. «Однако наши инструменты показали, что для одной системы CRISPR-Cas может быть несколько PAM, и некоторые PAM явно работают лучше, чем другие, как часть CRISPR, распознающего свою целевую ДНК».Исследователи уже используют PAM-SCANR для идентификации PAM для систем CRISPR-Cas, которые могут стать следующим поколением инструментов CRISPR.
Они также работают, чтобы определить, как различные PAM для конкретной системы CRISPR-Cas могут повлиять на эффективность этой системы в любом конкретном приложении.«Например, мы хотим знать, влияет ли изменчивость среди PAM на редактирование генома и нашу способность предсказывать нецелевые сайты — места, где система CRISPR-Cas может атаковать не только целевую ДНК», — говорит Бейзел.