«Мы хотим понять, с какой гибкостью развиваются организмы», — говорит Юнкер. Если повреждение происходит во время эмбрионального развития, например, из-за мутации или влияния окружающей среды, механизмы восстановления гарантируют, что впоследствии животное будет выглядеть здоровым. Только происхождение каждой клетки может рассказать правду — степень повреждения и механизм восстановления. Даже сердце взрослой рыбки данио может восстанавливаться после травмы. «Это повторяется процесс биологического развития или происходит что-то новое?» Юнкер задается вопросом. «А клетки меняются и берут на себя другие задачи?» Однако в других случаях недостающий тип клеток вызывает конкретное заболевание.
В будущем исследователи смогут использовать деревья происхождения всех клеток, отслеживаемых с помощью LINNAEUS, для формулирования новых гипотез по таким вопросам.Быстрая заплатка вызывает случайное рубцеваниеЭтот метод основан на шрамах в ДНК, которые, вместе взятые, работают как штрих-код, по которому можно определить происхождение каждой клетки. В то время как эмбрионы рыбок данио все еще находятся на одноклеточной стадии, команда Юнкера внедряет систему CRISPR-Cas9.
В течение следующих восьми часов Cas9 неоднократно вырезал последовательность, которая никогда не понадобится рыбе: ген красного флуоресцентного белка (RFP). Красное свечение эмбриона постепенно тускнеет, и на ранах ДНК образуются тысячи различных шрамов. «CRISPR всегда делает разрез в точной точке. Но у клеток есть не более 15 минут на восстановление до следующего клеточного деления», — говорит Юнкер. «Патчинг должен производиться быстро, чтобы части хромосом были как бы склеены друг с другом. Именно здесь случаются ошибки.
Шрамы в ДНК имеют произвольную длину, и их точное положение также варьируется». Дочерние клетки наследуют генетические рубцы во время деления клеток. Таким образом, клетки, происходящие от общего предка, можно идентифицировать по их генетическим рубцам.
В то время как секвенирование одноклеточной РНК отображает тысячи клеток по типу клеток, рубцы показывают миллионы связей между клетками. Реконструкция деревьев родословных из этого клубка данных столкнулась с множеством проблем. Некоторые шрамы могут появиться особенно часто. «Это опасно, потому что, если одна и та же последовательность рубцов создается как в клетках сердца, так и в клетках мозга, можно ошибочно предположить, что у них общий предок», — говорит Юнкер. Поэтому нам нужно было знать, каким последовательностям мы не можем доверять, и отфильтровать их ». Кроме того, не все шрамы в клетке можно найти, — говорит биоинформатик Бастиан Спанджаард, один из ведущих авторов исследования.« Итак, мы разработали метод, способный восполнения пробелов в данных, которые позволяют нам строить деревья родословной ».
Увеличение набора данныхКонечным результатом являются деревья родословной с красочными круговыми диаграммами, где ветви разделяются. Каждое деление представляет собой рубец, и каждый цвет на круговой диаграмме показывает, в каком типе ячеек оно встречается. Исследователи могут увеличивать это компактное представление чрезвычайно большого набора данных с любой детализацией.
«В сердце, например, есть два едва различимых типа клеток. Но древовидные линии показывают, что их развитие очень рано разветвляется в разных направлениях», — говорит Юнкер. «Далее мы хотим увидеть, где эти типы клеток встречаются в сердцах рыб.
Это часто является первым признаком того, какую функцию они выполняют». Его лаборатория продолжает использовать рыбок данио в качестве модельного организма, но Юнкер также видит большой потенциал в применении этого метода к органоидам человека.
В конечном итоге это может помочь нам понять, какие мутации у пациента вызывают необратимое повреждение деревьев клеточных линий.