Система CRISPR / Cas9 нацелена на определенные последовательности ДНК и вызывает чистые разрезы на обеих цепях ДНК. В клетках млекопитающих такие разрезы помечаются и быстро восстанавливаются системой экстренной репарации, называемой NHEJ (для негомологичного соединения концов). NHEJ эффективен, но не очень точен и часто приводит к вставке или удалению нескольких оснований ДНК в сайте репарации. Поскольку ДНК считывается кодонами из трех оснований одновременно, такие небольшие изменения в критических положениях часто нарушают функцию соответствующего гена и его белкового продукта.
Роберт Ян Леббинк из Медицинского центра Университета в Утрехте, Нидерланды, и его коллеги пришли к выводу, что CRISPR / Cas9 может нацеливаться и мутировать латентную ДНК герпесвируса в инфицированных клетках человека и, таким образом, потенциально предотвращать заболевания, связанные с вирусом герпеса. Чтобы проверить это, исследователи разработали специальные направляющие (ж) РНК — последовательности, которые комплементарны жизненно важным частям вирусного генома и функционируют как «молекулярные адреса». Эти гРНК в сочетании с частью системы CRISPR / Cas9 «молекулярные ножницы» должны вызывать определенные разрезы и последующие мутации в ДНК герпесвируса и, таким образом, наносить вред вирусам.В своем систематическом подходе исследователи рассмотрели трех различных членов группы вирусов герпеса: вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1), вызывающий герпес и кератит герпеса; цитомегаловирус человека (HCMV), наиболее частая вирусная причина врожденных дефектов (когда вирус передается от матери к плоду); и вирус Эпштейна-Барра (EBV), вызывающий инфекционный мононуклеоз и несколько типов рака.
Работая с клетками лимфомы, латентно инфицированными EBV, исследователи показали, что введение гРНК, нацеленных на конкретные последовательности ДНК EBV, может вызвать мутации в целевых сайтах. Такие мутации могут устранить основные функции вируса, а также дестабилизировать молекулы вирусной ДНК. В соответствии с этим, исследователи сообщают, что, используя две разные гРНК, нацеленные на важный ген EBV, они могут вызвать потерю более 95% геномов EBV из клеток-хозяев.
Во время латентной инфекции геномы HCMV существуют в виде кольцевых молекул ДНК в ядре клеток-хозяев. После реактивации вируса репликация HCMV происходит медленно. Исследователи обнаружили, что при использовании соответствующих gRNA редактирование CRISPR / Cas9 может эффективно нарушать репликацию HCMV.
Однако они также наблюдали появление вариантов ускользания, которые обходят редактирование CRISPR / Cas9, предполагая, что одновременное редактирование в нескольких критических сайтах в геноме HCMV необходимо, чтобы избежать развития устойчивых геномов.По сравнению с HCMV, HSV-1 размножается намного быстрее. Когда исследователи протестировали различные гРНК, нацеленные на разные основные гены HSV-1, в сочетании с CRISPR / Cas9, они обнаружили, что многие из них способны снижать репликацию вируса. Когда они объединили две из этих gRNA, тем самым одновременно нацелившись на два основных гена, они смогли полностью подавить репликацию HSV-1.
С другой стороны, они не могли вызвать редактирование во время латентной фазы, то есть когда вирусная ДНК не размножалась активно.«Мы наблюдали высокоэффективный и специфический клиренс EBV из латентно инфицированных опухолевых клеток и нарушение репликации HSV-1 и HCMV в клетках человека», — резюмируют исследователи.
Далее они говорят: «Хотя CRISPR / Cas9 был неэффективен в управлении геномной инженерией покоящегося HSV-1, репликация вируса при реактивации покоящегося HSV-1 была эффективно отменена с использованием анти-HSV-1 гРНК». Их результаты, как они надеются, «могут позволить разработать эффективные терапевтические стратегии для воздействия на вирусы герпеса человека как при латентных, так и при продуктивных инфекциях».